[논문]동자개 Pseudobagrus fulvidraco 정자 동결보존

정민환; 홍창기; 임재현; 구인본; 박주환

doi:10.23005/ksmls.2023.8.2.115

동자개 Pseudobagrus fulvidraco 정자 동결보존
Sperm Cryopreservation of Korean Bullhead Pseudobagrus fulvidraco 원문보기

한국해양생명과학회지 = Journal of marine life science, v.8 no.2, 2023년, pp.115 - 120

정민환 (국립수산과학원 육종연구센터) , 홍창기 (국립수산과학원 중앙내수면연구소) , 임재현 (국립수산과학원 중앙내수면연구소) , 구인본 (국립수산과학원 중앙내수면연구소) , 박주환 (국립수산과학원 중앙내수면연구소)

초록
AI-Helper

본 연구는 동자개 정자의 동결보존을 위해 동결보존제의 최적 농도와 적정 희석액을 구명하여 정자를 최상의 상태로 보존하여 인공종자를 생산하는데 목적이 있다. 실험은 3종의 희석액(I: 300 mM glycose, II: Kurokura extender, III: Li extender), 4종의 동결보존제(dimethyl sulfoxide, ethylene glycol, methanol and glycerol)와 4개의 동결보존제 농도(5, 10, 15, 20%)를 조합하여 대하여 조사하였다. 동결보존한 정자를 해동한 후 정자의 생존율과 정자활성지수로 동결보존제의 효과를 평가하였다. 희석액 III(Li extender)과 10과 15%의 methanol을 조합했을 때 동자개 정자의 생존율과 정자활성지수는 각각 66.9 ± 8.7, 67.3 ± 13.1%과 2.6 ± 0.4, 2.6 ± 0.5로 다른 희석액과 동결보존제보다 높았다.

Abstract ▼ AI-Helper

This study aims to find out a suitable extender and cryoprotective agent (CPA) for cryopreservation and its optimum concentration in order to conduct planned artificial seed production of Korean bullhead Pseudobagrus fulvidraco and to preserve superior sperm. Experiments were designed to investigate the effects of the different combinations of three extenders (I: 300 mM glycose, II: Kurokura extender, III: Li extender), four cryoprotectants (dimethyl sulfoxide, ethylene glycol, methanol and glycerol) and four concentrations (5, 10, 15, 20%) on the cryopreservation of Korean bullhead sperm. Postthawed sperm survival rate and sperm activity index (SAI) were detected to evaluate the effects of sperm cryopreservation. The optimal combination of extender and CPA for cryopreservation of Korean bullhead sperm was extender III + 10 and 15% methanol, resulting in a survival rate and SAI of 66.9 ± 8.7, 67.3 ± 13.1% and 2.6 ± 0.4, 2.6 ± 0.5 respectively, which was higher than had been achieved with other extenders and CPAs.

주제어

표/그림 (4)

그림 Fig. 1. Effects of extenders, cryoprotective agents (CPAs) and concentrations on survival rate of post-thawed sperm of Korean bullhead Pseudobagrus fulvidraco. ND: no data.
표 Table 1. Numerical index for the evaluation of sperm activity index (SAI)
표 Table 2. Biochemical properties in seminal plasma of Korean bullhead Pseudobagrus fulvidraco
그림 Fig. 2. Effects of extenders, cryoprotective agents (CPAs) and concentrations on sperm activity index of post-thawed sperm of Korean bullhead Pseudobagrus fulvidraco. ND: no data.

AI 본문요약
AI-Helper

문제 정의

본 연구에서는 고부가가치 내수면 양식 어종인 동자개의 효율적인 인공종자생산 기술개발을 위한 연구의 일환으로 동자개의 정액 동결보존 시 최적의 희석액과 CPA의 종류 및 농도 조합을 알아보고자 한다.

제안 방법

CPA는 정액 동결보존 연구에서 가장 많이 사용되는 dimethyl sulfoxide (DMSO), ethylene glycol (EG), methanol 및 glycerol을 사용하였으며, 농도는 각각 5, 10, 15, 20%로 하였다.
동자개 정액의 동결보존 시 최적의 희석액과 CPA 종류 및 농도를 조사하기 위하여 희석액 3종과 CPA 4종 및 CPA 별 4개의 농도를 조합하여 사용하였다.
본 연구에서 동자개 정액의 동결보존 시 적정 희석액과 CPA 종류 및 농도를 조사하기 위하여 희석액 3종, CPA 4종, 각 CPA 별 4개의 농도, 총 48개의 조합을 만들어 적정 동자개 정액 동결보존 조건을 조사하였다. 48개의 조합으로 만들어진 용액에 침지하여 50일간 -196℃의 액체질소에 보존 한 결과, 해동 정자의 생존율이 60% 이상, SAI 가 2.
희석액 3종과 CPA 4종의 농도별로 냉동된 각각의 정액 straw를 액체질소에 50일간 보존하였다. 이후에 각각의 정액 straw를 25℃의 항온수조에 넣어 60초간 급속 해동한 다음, 정자의 생존율 및 운동성을 측정하였다.
정자의 생존율과 운동성은 해동 정액과 담수를 1:100으로 희석하여 slide glass 위에 분주하여 광학현미경으로 관찰하였다. 생존율은 머리와 꼬리의 움직임이 관찰되는 정자는 생존한 것으로 판단하였으며, 운동성은 Table 1의 운동지수에 따라 점수를 부여하고, 각각의 운동점수와 운동 정자의 비율에 따라 Strüssmann et al.
희석액 3종과 CPA 4종의 농도별 조합에 따른 동자개 정액의 동결보존 효과를 비교하기 위하여 각각의 희석액과 농도별 CPA가 첨가된 용액에 정액을 20:1의 비율로 희석하여 3분간 평형시간을 준 다음 0.25 mL straw에 봉입하였다. 이 후 각 straw를 액체질소 증기(-76℃)로 3분간 1차 냉각 한 다음, 액체질소(-196℃)에 바로 넣어 급속 냉각하였다.

대상 데이터

실험에 사용한 동자개는 국립수산과학원 중앙내수면연구소에서 사육중인 전장 19.9 ± 3.2 cm, 체중 82.4 ± 39.5 g의 수컷 18마리를 사용하였으며, 1회 실험 시 6마리씩 총 3회 실시하였다

성능/효과

본 연구에서 동자개 정액의 동결보존 시 적정 희석액과 CPA 종류 및 농도를 조사하기 위하여 희석액 3종, CPA 4종, 각 CPA 별 4개의 농도, 총 48개의 조합을 만들어 적정 동자개 정액 동결보존 조건을 조사하였다. 48개의 조합으로 만들어진 용액에 침지하여 50일간 -196℃의 액체질소에 보존 한 결과, 해동 정자의 생존율이 60% 이상, SAI 가 2.5 이상인 조합은 희석액은 Ⅲ, CPA는 methanol, 농도는 10%와 15%였다.
본 연구에서는 300 mM glycose(희석액 Ⅰ)로 조합한 용액에 침지하여 동결보존 한 해동 정자의 생존율과 SAI는 없거나 매우 낮았다. 그러나 다른 담수 어류의 정장 이온 농도를 바탕으로 제조한 ASP를 희석액으로 사용하여 조합한 용액에 침지하여 동결보존 한 해동 정자는 CPA 종류와 농도에 따라 각기 다르지만 높은 생존율과 운동성을 보였다. 따라서 정액 동결보존 시 종 특성을 고려한 ASP를 희석액으로 사용하는 것이 유리할 수 있다고 판단된다.
그러나 다른 담수 어류의 정장 이온 농도를 바탕으로 제조한 ASP를 희석액으로 사용하여 조합한 용액에 침지하여 동결보존 한 해동 정자는 CPA 종류와 농도에 따라 각기 다르지만 높은 생존율과 운동성을 보였다. 따라서 정액 동결보존 시 종 특성을 고려한 ASP를 희석액으로 사용하는 것이 유리할 수 있다고 판단된다.
본 연구를 통해 담수 어류의 정액 동결보존 시 정장의 이온과 삼투질 농도를 고려하여 희석액을 선택하는 것은 중요하다고 사료되며, CPA로 methanol을 우선적으로 선택하는 것을 조심스럽게 추천한다.
일반적으로 체외수정을 하는 어류의 정자는 정소 내에서는 비활성 상태로 있다가 방정이 이루어지면서 환경수의 삼투질농도 등의 물리 · 화학적 요인에 의해 운동성을 획득하며, 담수 어류의 정자는 정장보다 삼투질농도가 낮은 저장액에서, 해수 어류의 정자는 정장보다 삼투질농도가 높은 고장액에서 운동성이 개시되는 것으로 알려져 있다(Morisawa and Suzuki, 1980). 본 연구에서 동자개 정장의 삼투질농도는 259.3 mOsm/kg로 일반적인 담수 어류의 정장 삼투질농도인 82~317 mOsm/kg (Morisawa et al., 1983; Morisawa, 1985; Alavi et al., 2004; Jeong et al., 2014) 범위에 속하였으며, 정액 동결보존 직전 실시한 정자활성 조사에서 정액을 담수에 희석하여 정자 운동성을 측정한 결과 왕성한 활성을 보였다.
(1997)은 당질이 포함된 희석액은 정자 세포막의 인지질을 안정시켜 보존 효과를 높인다고 보고하였다. 본 연구에서는 300 mM glycose(희석액 Ⅰ)로 조합한 용액에 침지하여 동결보존 한 해동 정자의 생존율과 SAI는 없거나 매우 낮았다. 그러나 다른 담수 어류의 정장 이온 농도를 바탕으로 제조한 ASP를 희석액으로 사용하여 조합한 용액에 침지하여 동결보존 한 해동 정자는 CPA 종류와 농도에 따라 각기 다르지만 높은 생존율과 운동성을 보였다.
, 2014). 본 연구에서도 methanol이 다른 CPA 보다 높은 생존율과 SAI를 보였다.
희석액 Ⅲ에 각각의 CPA 및 농도로 조합한 용액으로 동결보존 한 동자개 정액의 해동 후 정자의 생존율이 60%가 넘는 조합은 10, 15% methanol 각각 66.9 ± 8.7%, 67.3 ± 13.1%로 다른 조합으로 동결보존 한 조합 보다 높았다

후속연구

특히 수컷에서 정액을 확보하기 위해서 일반적으로 수컷 친어의 복부를 절개하여 정소를 적출/분쇄하여 사용하는 생식소 절개법을 많이 활용하기 때문에 한번 사용한 수컷의 재활용은 불가능하다. 따라서 특정 수컷 개체를 이용한 지속적인 후대생산 또는 수회에 나눠서 이뤄지는 인공수정 실험 등 특수한 목적을 수행하기 위해서는 정액의 장기 보존 방법이 필요하다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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