[논문]블루베리로부터 분리된 Lactiplantibacillus argentratensis의 병원성균에 대한 항균활성

김길하; 김완섭

doi:10.22424/jdsb.2023.41.4.191

[국내논문] 블루베리로부터 분리된 Lactiplantibacillus argentratensis의 병원성균에 대한 항균활성
Antibacterial Activity against Pathogenic Bacteria of Lactiplantibacillus argentratensis Isolated from Blueberries 원문보기

Journal of dairy science and biotechnology, v.41 no.4, 2023년, pp.191 - 202

(한경국립대학교 동물생명융합학부 동물응용과학전공) , 김길하 (한경국립대학교 동물생명융합학부 동물응용과학전공) , (한경국립대학교 동물생명융합학부 동물응용과학전공) , 김완섭 (한경국립대학교 동물생명융합학부 동물응용과학전공)

초록
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본 연구는 블루베리(Vaccinium)로부터 유산균을 분리하였다. 분리된 유산균은 호기와 혐기에서 모두 성장이 가능하였고, 그람염색에 의해 확인한 결과, 형태는 간상형이며, 그람 양성임을 확인하였다. 또한 균을 동정한 결과, L. argentoratensis와 높은 상동성을 나타내었다. 이 균으로부터 배양 상징액을 분리하여 병원성균인 Salmonella와 Escherichia에 대한 항균활성을 측정하였다. 시험에 이용된 Salmonella는 S. Enteritidis NCCP 16947, S. Typhimurium NCCP 16960 그리고 S. Thompson NCCP 11704로 L. argentoratensis의 배양 상징액은 이들의 성장을 현저히 억제하였다. 특히 배양 상징액의 농도가 높을수록 항균활성은 증가하였다. 더욱이 E. coli strains(E. coli KCCM 11569, E. coli KCCM 11587, E. coli KCCM 11591, E. coli KCCM 11596, E. coli KCCM 11600)에 대한 항균활성도 Salmonella의 결과와 같이 농도가 높을수록 현저한 항균활성을 보여주었다. 항균물질이 열과 pH에 안정한지를 알아보기 위하여 유산균 배양 상징액을 각각 65℃에서 30 min, 75℃에서 15 min, 85℃에서 10 min, 100℃에서 5 min의 조건으로 열처리한 후, 5% 첨가에 의해서 병원성 균주에 대한 항균활성을 측정한 결과 열처리전과 동일한 항균활성을 보여주었다. 그러나 배양 상징액의 pH 3.73을 7.0으로 조정한 시험에서는 항균활성을 나타내지 않았다. 따라서 병원성균에 항균활성을 나타내는 물질은 열에 안정하고 pH변화에는 불안정한 것을 보여주었다.

Abstract ▼ AI-Helper

In this study, lactic acid bacteria (LAB) was isolated from blueberries. The isolated LAB were rod-shaped and gram-positive, as shown using gram staining. In addition, the identified bacteria showed high homology to Lactiplantibacillus argentoratensis. The culture supernatant was isolated from L. argentoratensis and its antibacterial activity against the pathogenic bacteria Salmonella and Escherichia was analyzed. Culture supernatants of L. argentoratensis significantly inhibited the growth of Salmonella. Enteritidis NCCP 16947, Salmonella Typhimurium NCCP 16960, and Salmonella. Thompson NCCP 11704. Interestingly, the higher the concentration of the culture supernatant, the more significant was the antibacterial activity. Additionally, the culture supernatant of L. argentoratensis showed significant antibacterial activity against Escherichia strains. To determine whether the antibacterial substance is stable to heat and pH, the LAB culture supernatant was heat-treated under 65℃ for 30 min, 75℃ for 15 min, 85℃ for 10 min, and 100℃ for 5 min. Measurement of antibacterial activity against pathogenic strains by adding 5% of heat-treated culture medium showed the same antibacterial activity as before heat treatment. However, in a test where the pH of the culture supernatant was adjusted to 7.0 from 3.73, no antibacterial activity was observed.

Keyword

표/그림 (10)

그림 Fig. 1. Gram positive Lactiplantibacillus argentoratensis isolated from blueberry (gram stain, bar=10 μm).
그림 Fig. 2. Hemolytic activities of Lactiplantibacillus argentoratensis isolated from blueberry.
그림 Fig. 3. Antibacterial activity against Salmonella by adding supernatant of lactic acid bacteria isolated from Vaccinium. (A) Salmonella Enteritidis NCCP 16947, (B) Salmonella Typhimurium NCCP 16960, (C) Salmonella Thompson NCCP 11704. a, 40 μL supernatant; b, 20 μL supernatant; c, 10 μL supernatant; d, 5 μL supernatant.
그림 Fig. 4. Antibacterial activity against Escherichia by adding supernatant of lactic acid bacteria isolated from Vaccinium. (A) E. coli KCCM 11569, (B) E. coli KCCM 11587, (C) E. coli KCCM 11591, (D) E. coli KCCM 11596, (E) E. coli KCCM 11600, a, 40 μL supernatant; b, 20 μL supernatant; c, 10 μL supernatant; d, 5 μL supernatant.
그림 Fig. 5. Antibacterial activity against Salmonella by adding supernatant of lactic acid bacteria isolated from Vaccinium. (A) Salmonella Enteritidis NCCP 16947, (B) Salmonella Typhimurium NCCP 16960, (C) Salmonella Thompson NCCP 11704.
그림 Fig. 6. Antibacterial activity against Escherichia by adding supernatant of lactic acid bacteria isolated from Vaccinium. (A) E. coli KCCM 11569, (B) E. coli KCCM 11587, (C) E. coli KCCM 11591, (D) E. coli KCCM 11596, (E) E. coli KCCM 11600.
그림 Fig. 7. Antibacterial activity against Salmonella by heat treatment of the supernatant of lactic acid bacteria isolated from Vaccinium. (A) Salmonella Enteritidis NCCP 16947, (B) Salmonella Typhimurium NCCP 16960, (C) Salmonella Thompson NCCP 11704.
그림 Fig. 8. Antibacterial activity against Escherichia by heat treatment of the supernatant of lactic acid bacteria isolated from Vaccinium. (A) E. coli KCCM 11569, (B) E. coli KCCM 11587, (C) E. coli KCCM 11591, (D) E. coli KCCM 11596, (E) E. coli KCCM 11600.
그림 Fig. 9. Antibacterial activity against Salmonella by pH exchanges of the supernatant of lactic acid bacteria isolated from Vaccinium. (A) Salmonella Enteritidis NCCP 16947, (B) Salmonella Typhimurium NCCP 16960, (C) Salmonella Thompson NCCP 11704.
그림 Fig. 10. Antibacterial activity against Escherichia by pH exchanges of the supernatant of lactic acid bacteria isolated from Vaccinium. (A) E. coli KCCM 11569, (B) E. coli KCCM 11587, (C) E. coli KCCM 11591, (D) E. coli KCCM 11596, (E) E. coli KCCM 11600.

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구는 블루베리로부터 유산균을 분리·동정하고, 동정된 유산균의 배양 상징액으로부터 병원성균에 대한 항균 활성을 확인하였다.

제안 방법

도말한 MRS agar를 37℃에서 콜로니가 형성될 때까지 혐기 또는 호기 배양하였다. 형성된 콜로니는 모양, 크기 및 그람염색법을 통하여 유산균을 선택하였다. 선택된 유산균은 수탁업체(Sogent, Korea)에 의뢰하여 동정하였다.
용혈 활성은 콜로니 주위의 가수 분해 맑은 영역(β-용혈), 콜로니 주변의 부분 가수 분해 및 녹색 색조 영역(α-용혈), 또는 콜로니 주위의 영역 없음(용혈 γ)을 관찰하였다
Petri dish에 굳어진 각각의 병원성균에 분리된 유산균 배양 상징액을 40, 20, 10, 그리고 5 μL의 농도로 조정하여 멸균된 paper disc(Advantec)에 흡수시켜 37℃에 배양하면서 항균활성을 측정하였다.
블루베리 유래 유산균 배양 상징액의 병원성균에 대한 농도별 항균 활성을 확인하기 위해 96 well plate 법을 이용하여 측정하였다. 유산균 배양 상징액을 각 LB배지에 20%, 10%, 5%, 2.5% 농도로 조정하여 첨가하였다. 그리고 예비 배양한 각각의 병원성균을 1% 접종하였다.
그리고 예비 배양한 각각의 병원성균을 1% 접종하였다. 병원성균의 성장은 37℃에서 배양하면서 3시간 간격으로 Microplate Reader(Bio-Rad, USA)를 이용하여 655 nm의 파장에서 흡광도(optical density)를 측정하였다.
블루베리 유래 유산균으로부터 얻어진 배양 상징액의 항균활성이 열과 pH에 안정성이 있는지를 확인하였다. 열 안정성 시험은 분리된 유산균의 배양 상징액을 각각 65℃에서 30 min, 75℃에서 15 min, 85℃에서 10 min, 100℃에서 5 min의 조건으로 열처리한 후, 5% 첨가에 의해서 병원성균에 대한 항균활성을 측정하였다.
블루베리 유래 유산균으로부터 얻어진 배양 상징액의 항균활성이 열과 pH에 안정성이 있는지를 확인하였다. 열 안정성 시험은 분리된 유산균의 배양 상징액을 각각 65℃에서 30 min, 75℃에서 15 min, 85℃에서 10 min, 100℃에서 5 min의 조건으로 열처리한 후, 5% 첨가에 의해서 병원성균에 대한 항균활성을 측정하였다. 그리고 pH 변화에 대한 항균활성 여부는 1N NaOH를 이용하여 배양 상징액을 pH 7.
열 안정성 시험은 분리된 유산균의 배양 상징액을 각각 65℃에서 30 min, 75℃에서 15 min, 85℃에서 10 min, 100℃에서 5 min의 조건으로 열처리한 후, 5% 첨가에 의해서 병원성균에 대한 항균활성을 측정하였다. 그리고 pH 변화에 대한 항균활성 여부는 1N NaOH를 이용하여 배양 상징액을 pH 7.0으로 조정한 후, 배양액에 5% 첨가에 의해서 병원성균에 대한 항균활성을 측정하였다. 각각의 병원성균의 성장은 37℃에서 24시간동안 배양하면서 6시간 간격으로 흡광도를 측정하여 확인하였다.
블루베리유래 L. argentoratensis로부터 얻어진 배양 상징액의 항균 활성이 열에 대하여 안정한지를 알아보기 위하여 배양 상징액을 각각 65℃에서 30 min, 75℃에서 15 min, 85℃에서 10 min, 100℃에서 5 min의 조건으로 열처리한 후, 5% 첨가에 의해서 병원성 균주에 대한 항균활성을 측정하였다. Fig.
그리고 Kim and Lim[28]은 김치로부터 분리된 L. plantarum KI69의 기능성 식품에 적용가능 여부를 시험하였다. L.

대상 데이터

coli KCCM 11596, 그리고 E. coli KCCM 11600은 한국 미생물 보존 센터에서 구입하였다. 그리고 Salmonella Enteritidis NCCP 16947, Salmonella Thompson NCCP 11704, Salmonella Typhimurium NCCP 16960은 국가 병원체 자원은행에서 구입하여 실험에 사용하였다.
coli KCCM 11600은 한국 미생물 보존 센터에서 구입하였다. 그리고 Salmonella Enteritidis NCCP 16947, Salmonella Thompson NCCP 11704, Salmonella Typhimurium NCCP 16960은 국가 병원체 자원은행에서 구입하여 실험에 사용하였다. Escherichia와 Salmonella는 Luria-Bertani(LB) broth(Difco, USA)를 사용하여 37℃의 항온기에서 배양하였다.

이론/모형

블루베리로부터 분리된 유산균의 상징액의 병원성균에 대한 항균활성 여부는 paper disc를 이용한 확산법으로 확인하였다. 20 mL의 LB agar는 125℃에서 20분 멸균하였고, 배지 온도를 50℃까지 냉각 후, 각각의 병원성균인 S.
블루베리 유래 유산균 배양 상징액의 병원성균에 대한 농도별 항균 활성을 확인하기 위해 96 well plate 법을 이용하여 측정하였다. 유산균 배양 상징액을 각 LB배지에 20%, 10%, 5%, 2.
발효가 끝난 블루베리를 멸균 증류수를 첨가하여 균질한 후, MRS agar에 도말하여 37℃에서 콜로니가 형성될 때까지 혐기 또는 호기 배양하였다. 얻어진 콜로니는 모양, 크기 및 그람염색법을 통하여 유산균을 선택하였다. 선택된 유산균은 간상의 형태와 그람 양성을 보여주었다(Fig.
블루베리 유래 유산균인 L. argentoratensis 배양 상징액의 병원성균에 대한 항균활성을 paper disc법으로 확인하였다. 병원성균인 Salmonella와 Escherichia에 대한 항균활성은 각각 Figs.
블루베리유래 L. argentoratensis로부터 얻어진 배양 상징액의 항균 활성 농도를 측정하기 위해 96 well plate법을 이용하여 측정하였다. Figs.

성능/효과

1). 선택된 유산균의 미생물 동정을 확인한 결과, Lactiplantibacillus argentoratensis strain DKO 22와 99%의 상동성을 나타내었다. 한편, L.
argentoratensis로부터 얻어진 상징액은 시험에 이용된 3종의 Salmonella에 대하여 40과 20 μL의 농도에서 현저한 항균활성을 나타내었다
Escherichia에 대하여 Salmonella의 항균결과와 같이 40과20 μL의 농도에서 현저한 항균활성을 나타내었다
따라서 블루베리 유래 L. argentoratensis로부터 얻어진 상징액은 병원성균인 Salmonella와 Escherichia의 성장을 억제하였다.
5 and 6은 병원성균에 대하여 L. argentoratensis의 배양 상징액을 20%, 10%, 5%, 2.5% 농도로 첨가한 후, 24시간 동안 균의 성장을 측정한 결과이다. Fig.
Typhimurium NCCP 16960 및 S. Thompson NCCP 11704 모두에서 배양초기부터 배양 종료까지 성장이 현저하게 억제되었다(Fig. 5).
coli 11600에 대한 항균 활성을 나타내었다. 시험에 사용된 5종의 대장균은 모두 20%와 10% 농도에서 배양 초기부터 24시간까지 현저한 항균 활성을 보여주었다(Fig. 6).
둘째, 본 실험 결과 항균활성은 열안정성을 보였기 때문에 일부 박테리오신은 열에 안정한 소형(<5kDa)의 펩타이드일 가능성도 있기 때문이다[32]
Typhimurium NCCP 16960에 첨가한 후, 성장을 나타낸 결과이다. 모든 온도 처리구에서 온도 처리하지 않은 대조구와 같은 항균활성을 보여주었다(Fig. 7).
coli KCCM 11600에 첨가하여 배양 24시간 동안 성장을 측정한 결과이다. 시험에 이용된 각각의 Escherichia는 모든 온도 처리구에서 온도 처리하지 않은 대조구와 같은 항균활성을 보여주었다(Fig. 8).
따라서 L. argentoratensis로부터 얻어진 배양 상징액의 병원성균에 대한 항균물질은 열에 안정한 것을 보여주었다.
Typhimurium NCCP 16960의 성장을 나타낸 결과이다. 상징액을 pH 7.0으로 조정 후 배지에 첨가하여 배양한 결과, Salmonella에 대한 배양 상징액의 항균활성은 나타나지 않았다. 그러나 배양 상징액의 pH를 조정하지 않은 시험구는 Salmonella에 항균활성을 나타낸 것으로 보아 성장억제 작용은 유기산에 의한 결과라고 판단된다.
0으로 조정 후 배지에 첨가하여 배양한 결과, Salmonella에 대한 배양 상징액의 항균활성은 나타나지 않았다. 그러나 배양 상징액의 pH를 조정하지 않은 시험구는 Salmonella에 항균활성을 나타낸 것으로 보아 성장억제 작용은 유기산에 의한 결과라고 판단된다. 한편 Fig.
coli KCCM 11600의 성장을 측정한 결과이다. 모든 시험구에서 배양 상징액의 pH를 7.0으로 조정하였을 때, 항균활성은 나타나지 않았다(Fig. 10).
aureus 그리고 B. cereus에 대하여 항균활성을 측정한 결과, 각각 15.44%, 50.79%, 58.62%, 37.85%로서 L. monocytogenes에서 가장 억제효과가 높았다고 하였다.
그리고 그들은 시험에 이용된 병원성균들이 각각 항균력이 다른 이유는 pH 강하, 산화환원 전위의 감소, 유해균과의 경쟁적 영양성분 소비, 과산화수소의 생성, 유기산의 종류, 박테리오신 등의 억제요소에 기인한다고 하였다. 따라서 우리들의 연구에서 병원성균에 대한 항균활성은 배양액을 pH 7.0으로 조정하였을 경우, 항균활성이 나타나지 않은 것으로 보아 유기산에 의한 항균효과가 가장 크다고 판단된다. 그러나 L.
본 연구에서 L. argentoratensis로부터 얻어진 배양 상징액이 Salmonella와 Escherichia에 대하여 항균활성과 hemolysis시험에 대한 음성 결과와 같이 충분히 발효유제품 및 생균제로 이용 시장내균총을 충분히 개선할 것으로 사료된다. 따라서 차기 연구에서는 블루베리로부터 분리된 L.

후속연구

따라서 우리들은 차후 L. argentoratensis의 배양 상징액을 농축하여 Tricine-SDS-PAGE에 의한 박테리오신의 활성 여부, 그리고 PCR에 의한 박테리오신 존재 여부 등을 관찰할 예정으로 있다.
따라서 차기 연구에서는 블루베리로부터 분리된 L. argentoratensis의 발효용 스타터로서 이용가능성, 병원성균에 대한 유기산에 의한 항균활성 이외에 박테리오신 규명, 그리고 장내 부착성 등의 추가적인 연구를 통하여 산업적 이용가치를 높일 필요성이 있다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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