[논문]RAW 264.7 세포에 대한 NF-κ B와 MAPK 활성 억제를 통한 개다래 열매 에탄올 추출물의 항염증 효과

박충무; 윤현서

doi:10.15268/ksim.2023.11.2.119

RAW 264.7 세포에 대한 NF-κ B와 MAPK 활성 억제를 통한 개다래 열매 에탄올 추출물의 항염증 효과
Anti-inflammatory Effects of Actinidia Polygama Ethanol Extract in through the Regulated NF-κ B and MAPKs Activation in LPS Stimulated RAW 264.7 Cells 원문보기

Journal of the Korean Society of Integrative Medicine = 대한통합의학회지, v.11 no.2, 2023년, pp.119 - 128

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Purpose : The fruit of Actinidia polygama has been used in oriental medicine for the treatment of gout, rheumatoid arthritis, and inflammation. Though A. polygama exhibited anti-inflammatory activity in RAW 264.7 cells and carrageenan-induced rat paw edema, the exact mechanism for anti-inflammation was not evaluated yet. In this study, the anti-inflammatory mechanisms of A. polygama ethanol extract (APEE) in lipopolysaccharide (LPS) stimulated RAW 264.7 cells. Methods : WST-1 assay was applied to analyze the cytotoxic effect of APEE in RAW 264.7 cells. The productions of nitric oxide (NO) and prostaglandin (PG) E2 were analyzed by the Griess reaction and enzyme immunoassay (EIA) assay, respectively. In addition, protein expressions for inducible NO synthase (iNOS) and cyclooxygenase (COX)-2 were measured by Western blot analysis. The activated status of an inflammatory transcription factor, NF-κ B, and its upstream signaling molecules, mitogen-activated protein kinases (MAPKs), was also evaluated by Western blot analysis. Results : As a result, APEE treatment did not exhibit any cytotoxicity until the concentration of 200 ㎍/㎖. APEE treatment significantly inhibited NO and PGE2 productions as well as their enzymes, iNOS and COX-2 in a dose-dependent manner. The inflammatory transcription factor, NF-κ B, was also attenuated by APEE treatment. In addition, the phosphorylated status of MAPKs such as extracellular regulated kinase (ERK), c-jun NH2 kinase (JNK), and p38, were significantly diminished by APEE treatment in LPS stimulated RAW 264.7 cells. Conclusion : Consequently, APEE treatment significantly attenuated the production of inflammatory mediators and their enzyme expressions in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. The inflammatory transcription factor, NF-κ B, and upstream signaling molecules, MAPKs, were also significantly attenuated by APEE treatment in LPS-activated RAW 264.7 cells. These results indicate that APEE might be a candidate to be utilized as a promising candidate for the treatment of inflammatory disorders.

주제어

표/그림 (6)

그림 Fig 1. APEE treatment showed no cytotoxic effect on RAW 264.7 cells Cytotoxicity was determined by WST-1 assay and the result is expressed as ratio compared to the control group (LPS treated cells). Data represent the mean±SD of triplicate experiments. Values sharing the same superscript are not significantly different at p<.05 by Duncan's multiple range test
그림 Fig 2. PYEE significantly attenuated NO and PGE₂ productions in LPS stimulated RAW 264.7 cells. Panel A and B show the concentrations of NO and PGE₂ in LPS stimulated RAW 264.7 cells. NO and PGE₂ concentrations were decided by the Griess reaction and EIA assay, respectively. Data represent the mean±SD of triplicate experiments. Values sharing the same superscript are not significantly different at p<.05 by Duncan's multiple range test
그림 Fig 3. PYEE attenuated protein expression levels of iNOS and COX-2 in LPS stimulated RAW 264.7 cells. Panel A shows protein expression levels of iNOS and COX-2 by APEE treatment. All signals were normalized to protein levels of actin, an internal control, and expressed as a ratio (Panel B). Data represent the mean±SD of triplicate experiments. Values sharing the same superscript are not significantly different at p<.05 by Duncan's multiple range test (APEE; A. polygama ethanol extract, LPS; lipopolysaccharide, iNOS; inducible nitric oxide synthase, COX-2; cyclooxygenase-2)
그림 Fig 4. APEE inhibited COX-2 expression in LPS stimulated RAW 264.7 cells. The expression level of COX-2 was visualized by immunofluorescent analysis with anti-COX-2 antibody-bound Alexa Fluor 594 (red)-conjugated secondary antibody. The nuclei were stained by DAPI (blue). The scale bar is 100 ㎛ (APEE; A. polygama ethanol extract, LPS; lipopolysaccharide, COX-2; cyclooxygenase-2)
그림 Fig 5. PYEE inhibited phosphorylation of NF-k B in LPS stimulated RAW 264.7 cells. Panel A shows phosphorylated status of p65 by APEE treatment. All signals were normalized to protein levels of actin, an internal control, and expressed as a ratio (Panel B). Data represent the mean±SD of triplicate experiments. Values sharing the same superscript are not significantly different at p<.05 by Duncan's multiple range test (APEE; A. polygama ethanol extract, LPS; lipopolysaccharide, NF-k B; nuclear factor-k B)
그림 Fig 6. PYEE inhibited phosphorylation of ERK and JNK in LPS stimulated RAW 264.7 cells. Panel A shows phosphorylation levels of ERK, JNK and p38 by APEE treatment. All signals were normalized to protein levels of actin, an internal control, and expressed as a ratio (Panel B). Data represent the mean±SD of triplicate experiments. Values sharing the same superscript are not significantly different at p<.05 by Duncan's multiple range test (APEE; A. polygama ethanol extract, LPS; lipopolysaccharide, ERK; extracellular signal-regulated kinase, JNK; c-Jun NH2-terminal kinase)

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 개다래 열매 추출물이 LPS로 자극된 생쥐 대식세포인 RAW 264.7세포에서의 항염증 기전을 분석함으로써 개다래 열매 추출물의 항염증 후보물질로서의 가치를 확인해보고자 한다.

제안 방법

Nitrite 생성억제 효과의 분석을 위하여 RAW 264.7 세포를 24 well plate에 파종하여 24시간 동안 배양하고 APEE를 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖의 농도로 처리하였다. 그리고 2시간 후 LPS를 1 ㎍/㎖의 농도로 처리하고 20시간 동안 다시 배양하여 염증 반응을 유도하였다.
Service, Korea)을 사용하여 분석하였다. RAW 264.7 세포를 24 well plate에 파종하여 24시간동안 배양하고 APEE를 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖의 농도로 처리하였다. 그리고 2시간 후 LPS를 1 ㎍/㎖의 농도로 처리하고 20시간동안 다시 배양하였다.
RAW 264.7세포를 100-㎜ dish에 파종하고 24시간 동안 배양하여 부착하고 APEE를 25, 50, 100, 200 s의 농도로 처리하였다. 그리고 2시간 후 LPS를 1 ㎍/㎖의 농도로 처리하고 20시간 동안 다시 배양하였다.
RAW 264.7세포를 cell culture slide(SPL life science, Pocheon, Korea)에 파종하여 24시간 동안 배양하고 APEE를 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖의 농도로 처리하였다. 그리고 2시간 후 LPS를 1 ㎍/㎖의 농도로 처리하고 20시간 동안 다시 배양하여 COX-2 발현을 유도하였다.
그리고 이들 염증 매개 물질의 발현을 조절하는 염증 매개 전사인자인 NF-κB와 그 상위 신호전달 물질인 MAPKs의 인산화 또한 Western blot으로 분석함으로써 APEE가 RAW 264.7 세포에서 보이는 정확한 항염증 기전을 확인하고자 하였다.
본 연구에서는 개다래 열매 에탄올 추출물(APEE)의 항염증 효과를 확인하기 위하여 생쥐 대식세포인 RAW 264.7 세포에 LPS를 처리하여 염증을 유도하고, 염증 매개 물질인 NO, PGE2의 생성과 이들의 생산을 유도하는 효소인 iNOS, COX-2의 발현정도를 Western blot으로 분석하였다. 그리고 이들 염증 매개 물질의 발현을 조절하는 염증 매개 전사인자인 NF-κB와 그 상위 신호전달 물질인 MAPKs의 인산화 또한 Western blot으로 분석함으로써 APEE가 RAW 264.
본 연구에서는 생쥐 대식세포인 RAW 264.7세포에 LPS를 이용하여 염증 반응을 유도하고 개다래 에탄올 추출물(APEE)의 항염증 기전을 분석하였다. 실험 결과 LPS에 의해 유도된 NO와 PGE2의 생성 뿐만 아니라 이들을 매개하는 효소인 iNOS와 COX-2의 단백질 발현 또한 APEE의 처리에 의해 농도 의존적으로 억제되었다.

대상 데이터

개다래 열매 추출물은 천일한약방(Daegu)에서 건초를 구입하여 건조된 시료 100 g을 분쇄한 후 주정(에탄올)을 1:4 (v/v)의 비율로 가해 초음파추출기(Powersonic410, Hhashin instrument Co., Korea)로 30분간 추출한 후, 80℃에서 3시간씩 2회 반복 추출하였다. 또한 여과된 추출액은 진공농축기(N-110, Eyela Co.

데이터처리

모든 실험 결과는 3회 반복 시행한 후 SPSS 통계 프로그램(version 25.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 평균 ± 표준편차(mean ±SD)로 나타냈다
실험군간의 유의성 검증을 위하여 일원배치 분산분석법(one-way ANOVA)을 이용하였고, Duncan's multiple range test를 사후 검증법으로 진행하였다.

이론/모형

APEE가 RAW 264.7 세포에 미치는 독성을 확인하기 위하여 WST-1 assay를 시행하였고, 그 결과는 Fig. 1에서 보는 것과 같이 본 실험에서 사용한 농도인 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖의 범위에서는 유의미한 세포 생존율의 변화는 없는 것으로 확인하였다.
7세포를 PBS로 2회 세척하고 200 ㎕의 protein lysis buffer(PRO-PREP, Intron Biotechnology, Korea)로 세포내 단백질을 추출하였다. 추출된 단백질의 농도는 bradford법을 이용하여 결정하였다. 전기영동을 위하여 50 ㎍의 추출된 단백질이 포함된 시료를 4x laemmli buffer(Bio-Rad Laboratories, USA)와 섞고 준비된 10 % SDS-polyacrylamide gel에 전기영동을 하였다.

성능/효과

본 실험에서는 Fig 5에서 보는 것과 같이 APEE가 LPS의 처리로 활성화된 NF-κB의 구성단백질인 p65의 인산화를 억제함으로써 염증을 억제한다는 것을 알 수 있었고, 또한 NF-κB의 상위신호전달체계인 MAPKs의 인산화의 정도 또한 Western blot으로 분석하였다. LPS로 인해 인산화가 유도된 ERK, JNK, p38의 활성 억제 정도를 확인한 결과 Fig 6과 같이 APEE는 p38의 인산화는 거의 억제하지 못한 반면 ERK의 인산화는 약하게, JNK의 인산화는 유의하게 억제하는 것을 볼 수 있었다. 이 결과를 통해 APEE는 MAPKs 중 JNK와 NF-κB의 인산화를 억제함으로써 염증을 조절한다는 것을 알 수 있었다.
결론적으로 APEE는 NF-κB와 ERK, JNK의 인산화를 억제하여 LPS로 인해 유도되는 염증 매개 물질인 NO, PGE2의 생성을 조절함으로써 염증을 억제하는 것으로 생각된다.
결론적으로 APEE는 RAW 264.7세포에서 LPS에 의해 과량 생성된 NO, PGE2의 농도와 매개하는 유전자인 iNOS와 COX-2 발현을 농도 의존적으로 억제하였다. 그리고 이 활성은 염증 전사인자인 NF-κB와 신호전달 물질인 ERK, JNK의 활성 억제를 통해 유도되는 것을 알 수 있었다.
1에서 보는 것과 같이 본 실험에서 사용한 농도인 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖의 범위에서는 유의미한 세포 생존율의 변화는 없는 것으로 확인하였다. 그리고 APEE가 LPS에 의해 유도된 염증에 대한 억제효과를 보이는지의 여부를 확인하기 위하여 NO와 PGE2의 생성 억제량을 확인한 결과, Fig 2에서 보는 바와 같이 APEE의 처리로 인해 NO와 PGE2의 생성이 농도 의존적으로 유의미하게 감소하는 결과를 확인할 수 있었다. 또한 이들의 합성을 매개하는 효소인 iNOS와 COX-2의 발현 또한 Fig 3에서와 같이 APEE의 처리로 인해 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다.
또한 이들의 합성을 매개하는 효소인 iNOS와 COX-2의 발현 또한 Fig 3에서와 같이 APEE의 처리로 인해 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다. 그리고 COX-2의 발현을 면역형광염색법으로 확인한 결과 Fig 4에서 보는 것과 같이 200 ㎍/㎖의 APEE를 처리한 RAW 264.7 세포는 COX-2의 발현이 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과를 통해 APEE는 LPS에 의해 유도된 iNOS와 COX-2의 발현을 억제함으로써 염증을 완화할 수 있는 능력이 있음을 알 수 있었다.
그리고 이 활성은 염증 전사인자인 NF-κB와 신호전달 물질인 ERK, JNK의 활성 억제를 통해 유도되는 것을 알 수 있었다.
또한 염증성 전사인자인 NF-κB 또한 APEE의 처리로 인해 유의적으로 억제되는 것을 발견할 수 있었다. 그리고 이들의 발현을 조절하는 상위신호전달 체계인 MAPKs 중 p38의 인산화는 억제되지 않았고, ERK는 약하게, JNK의 인산화는 강하게 억제되었다. 결론적으로 APEE는 NF-κB와 ERK, JNK의 인산화를 억제하여 LPS로 인해 유도되는 염증 매개 물질인 NO, PGE2의 생성을 조절함으로써 염증을 억제하는 것으로 생각된다.
또한 염증성 전사인자인 NF-κB 또한 APEE의 처리로 인해 유의적으로 억제되는 것을 발견할 수 있었다
본 실험에서는 Fig 5에서 보는 것과 같이 APEE가 LPS의 처리로 활성화된 NF-κB의 구성단백질인 p65의 인산화를 억제함으로써 염증을 억제한다는 것을 알 수 있었고, 또한 NF-κB의 상위신호전달체계인 MAPKs의 인산화의 정도 또한 Western blot으로 분석하였다
7세포에 LPS를 이용하여 염증 반응을 유도하고 개다래 에탄올 추출물(APEE)의 항염증 기전을 분석하였다. 실험 결과 LPS에 의해 유도된 NO와 PGE2의 생성 뿐만 아니라 이들을 매개하는 효소인 iNOS와 COX-2의 단백질 발현 또한 APEE의 처리에 의해 농도 의존적으로 억제되었다. 또한 염증성 전사인자인 NF-κB 또한 APEE의 처리로 인해 유의적으로 억제되는 것을 발견할 수 있었다.
7 세포는 COX-2의 발현이 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과를 통해 APEE는 LPS에 의해 유도된 iNOS와 COX-2의 발현을 억제함으로써 염증을 완화할 수 있는 능력이 있음을 알 수 있었다.
이 결과를 통해 APEE는 MAPKs 중 JNK와 NF-κB의 인산화를 억제함으로써 염증을 조절한다는 것을 알 수 있었다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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