[논문]매자나무 Ethyl acetate 분획물의 예쁜 꼬마선충 내의 항산화 효과

이재혁; 최지우; 김준형; 김대근

doi:10.22889/kjp.2023.54.2.66

매자나무 Ethyl acetate 분획물의 예쁜 꼬마선충 내의 항산화 효과
Antioxidant Activity of Ethyl acetate Fraction of Berberis koreana Palibin in Caenorhabditis elegans 원문보기

생약학회지, v.54 no.2, 2023년, pp.66 - 71

이재혁 (남부대학교 응급구조학과) , 최지우 (우석대학교 약학과) , 김준형 (우석대학교 식품생명공학과) , 김대근 (우석대학교 약학과)

Abstract ▼ AI-Helper

Ethyl acetate (EA) soluble fraction of the Berberis amurensis (Berberidaceae) methanol extract showed the potent DPPH radical scavenging activity through Caenorhabditis elegans model system. The EA fraction was measured for the activity of superoxide dismutase (SOD), catalase, and oxidative stress tolerance by using C. elegans along with reactive oxygen species (ROS) level. In addition, SOD-3 expression was conducted using a transgenic strain (CF1553) to confirm that the regulation of the stress response gene is responsible for the increased stress tolerance of C. elegans treated by the EA fraction. As a result, the EA soluble fraction of B. amurensis increased SOD and catalase activity, and decreased ROS accumulation in a dose-dependent manner. Furthermore, the EA fraction-treated CF1553 worm showed higher SOD-3::GFP intensity than the control worm.

주제어

표/그림 (6)

$Fig. 1. DPPH radical scavenging effects of the methanol extract, and its fractions from B. koreana.$ 그림 Fig. 1. DPPH radical scavenging effects of the methanol extract, and its fractions from B. koreana.
$Fig. 2. Effects of ethyl acetate fraction of B. koreana on the antioxidant enzyme activity of wild-type N2 nematode. (A) The enzymatic reaction of xanthine with xanthine oxidase was used to generate •O2- and the SOD activity was estimated spectrophotometrically through formazan formation by NBT reduction. The SOD activity was showed as a percentage of superoxide-scavenged amount per control. (B) Catalase activity was calculated from the concentration of residual H2O2, as determined by a spectrophotometric method. The catalase activity was expressed in U/mg protein. Data are expressed as the mean ± S.E.M. of three independent experiments. Differences compared to the control were considered significant at *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 by oneway ANOVA.$ 그림 Fig. 2. Effects of ethyl acetate fraction of B. koreana on the antioxidant enzyme activity of wild-type N2 nematode. (A) The enzymatic reaction of xanthine with xanthine oxidase was used to generate •O₂- and the SOD activity was estimated spectrophotometrically through formazan formation by NBT reduction. The SOD activity was showed as a percentage of superoxide-scavenged amount per control. (B) Catalase activity was calculated from the concentration of residual H₂O₂, as determined by a spectrophotometric method. The catalase activity was expressed in U/mg protein. Data are expressed as the mean ± S.E.M. of three independent experiments. Differences compared to the control were considered significant at *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 by oneway ANOVA.
$Fig. 3. Effects of ethyl acetate fraction of the B. koreana on the intracellular ROS levels of wild-type N2 nematodes. Intracellular ROS accumulation was examined in a microplate fluorescence reader at 535 nm (emission) and 485 nm (excitation). (A) Plates were read for 120 min. (B) The average percentages of intracellular ROS accumulation were presented. Differences compared with the control were considered significant at *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 by the one-way ANOVA.$ 그림 Fig. 3. Effects of ethyl acetate fraction of the B. koreana on the intracellular ROS levels of wild-type N2 nematodes. Intracellular ROS accumulation was examined in a microplate fluorescence reader at 535 nm (emission) and 485 nm (excitation). (A) Plates were read for 120 min. (B) The average percentages of intracellular ROS accumulation were presented. Differences compared with the control were considered significant at *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 by the one-way ANOVA.
$Fig. 4. Effects of ethyl acetate fractions of B. koreana on the stress tolerance of wild-type N2 nematodes. For the oxidative stress assays, worms were transferred to 96-well plate containing 1 mM of juglone liquid culture, and then their viability was scored. Statistical difference between the curves was analyzed by log-rank test.$ 그림 Fig. 4. Effects of ethyl acetate fractions of B. koreana on the stress tolerance of wild-type N2 nematodes. For the oxidative stress assays, worms were transferred to 96-well plate containing 1 mM of juglone liquid culture, and then their viability was scored. Statistical difference between the curves was analyzed by log-rank test.
$Fig. 5. Effect of ethyl acetate fraction of B. koreana on the expression of SOD-3 was determined using transgenic nematodes. (A) Images of SOD-3::GFP expression of CF1553 worm in the presence or absence of ethyl acetate fraction. (B) The mean GFP intensity of mutant was represented as mean ± S.E.M. of values from 19 to 25 animals per each experiment. The GFP intensity was quantified using Image software by determining average pixel intensity. Data are expressed as the mean ± standard deviation of three independent experiments. Differences compared with the control were considered significant at *p<0.05 and ***p<0.001 by one-way ANOVA.$ 그림 Fig. 5. Effect of ethyl acetate fraction of B. koreana on the expression of SOD-3 was determined using transgenic nematodes. (A) Images of SOD-3::GFP expression of CF1553 worm in the presence or absence of ethyl acetate fraction. (B) The mean GFP intensity of mutant was represented as mean ± S.E.M. of values from 19 to 25 animals per each experiment. The GFP intensity was quantified using Image software by determining average pixel intensity. Data are expressed as the mean ± standard deviation of three independent experiments. Differences compared with the control were considered significant at *p<0.05 and ***p<0.001 by one-way ANOVA.
$Table I. Effects of ethyl acetate fraction of B. koreana on the oxidative stress tolerance of C. elegans$ 표 Table I. Effects of ethyl acetate fraction of B. koreana on the oxidative stress tolerance of C. elegans

AI 본문요약
AI-Helper

제안 방법

추출 및 분획 − 매자나무를 음건세절 후 얻은 시료 500 g을 methanol로 50 ℃에서 5시간씩 2회 온침 추출하였다. 그 알코올 추출액을 수욕상에서 농축하여 methanol 엑스 약 43 g을 얻었으며, 이 methanol 엑스를 증류수로 현탁시킨 후 동량의 n-hexane(2.9 g), methylene chloride(1.4 g), ethyl acetate(0.6 g)과 n-butanol(14.5 g)으로 분획하여 각각의 분획물을 확보하였다.
형질 전환 선충 내 SOD-3의 발현 증가 효능 − 매자나무 ethyl acetate 분획의 선충 내에서 산화적 스트레스에 대한 저항 단백질의 증가 여부를 알려주는 SOD발현 유전자의 증가 여부를 SOD-3을 포함한 형질 전환 선충 CF1553을 사용하여 실험하였다

대상 데이터

실험재료 − 본 실험에 사용한 매자나무는 전초를 2023년 1월에 산림청 국립수목원에서 제공받아 김대근 교수가 검증한 후에 음건세절하여 사용하였으며, 표준품은 우석대학교 약학대학 생약표본실에 보관하고 있다(WS-22-009).

데이터처리

그룹 간의 통계적 유의성 검정은 Student’s t-test를 통해서 분석하였고 선충의 연속적인 생존도는 Log-rank test 분석 방법을 이용하였다
통계 분석 − 통계 자료의 값은 평균값 ± 표준오차(mean ± S.E.M.)로 표시하였다

성능/효과

결과적으로 CF1553 형질전환 선충에 ethyl acetate 분획 500 μg/mL 처리군이 대조군에 비해 39.6%의 상승된 SOD-3::GFP 발현율을 보여 주었다(*p<0.05, (Fig
매자나무 ethyl acetate 분획은 강한 DPPH free radical 소거활성을 나타냈으며, 예쁜꼬마선충 내의SOD 및 catalase의 활성을 농도 의존적으로 높여 주었다. 선충 세포 내의 ROS의 발생을 농도의존적으로 감소시켰으며, juglone으로 유도된 산화적 스트레스 조건에서 선충의 생존율을 농도 의존적으로 증가시켰다.
산화적 스트레스 저항성 증가 효능 − 매자나무 ethyl acetate 분획의 산화적 스트레스에 미치는 영향 평가에서 분획을 처리하지 않은 대조군 선충의 최고 생존시간은 22시간이었으나, ethyl acetate 분획 500 µg/mL 농도에서 생존시간을 40시간으로 증가시켰다
매자나무 ethyl acetate 분획은 강한 DPPH free radical 소거활성을 나타냈으며, 예쁜꼬마선충 내의SOD 및 catalase의 활성을 농도 의존적으로 높여 주었다. 선충 세포 내의 ROS의 발생을 농도의존적으로 감소시켰으며, juglone으로 유도된 산화적 스트레스 조건에서 선충의 생존율을 농도 의존적으로 증가시켰다. 형질전환 선충인 GFP-fused transgenic strain CF1553을 이용한 산화적 스트레스 관련 단백질 발현여부 실험에서는 대조군에 비해 농도의존적으로 상승된 형광발현율을 보여주여 산화적 스트레스에 저항하는 단백질이 발현됨이 확인되었다.
항산화 효소(SOD, Catalase) 활성 증가 효능 −Xanthine을 기질로 xanthine oxidase의 효소반응으로 생성되는 superoxide anion을 측정하여 SOD의 활성을 확인한 결과, 매자나무 ethyl acetate 분획물 투여군은 SOD의 활성을 농도의존적으로 증가시켰다
선충 세포 내의 ROS의 발생을 농도의존적으로 감소시켰으며, juglone으로 유도된 산화적 스트레스 조건에서 선충의 생존율을 농도 의존적으로 증가시켰다. 형질전환 선충인 GFP-fused transgenic strain CF1553을 이용한 산화적 스트레스 관련 단백질 발현여부 실험에서는 대조군에 비해 농도의존적으로 상승된 형광발현율을 보여주여 산화적 스트레스에 저항하는 단백질이 발현됨이 확인되었다. 이러한 결과는 매자나무 ethyl acetate 분획은 항산화 및 이와 관련된 질병에 대처하기 위한 자원으로서의 가치가 있을 것으로 사료된다.
활성산소종의 일종인 hydrogen peroxide를 대사시키는 catalase의 활성은 ethyl acetate 분획 500 μg/mL 투여군이 대조군에 비해 약 34.0% 증가시키는 것으로 확인되었다(**p<0.01)(Fig

후속연구

형질전환 선충인 GFP-fused transgenic strain CF1553을 이용한 산화적 스트레스 관련 단백질 발현여부 실험에서는 대조군에 비해 농도의존적으로 상승된 형광발현율을 보여주여 산화적 스트레스에 저항하는 단백질이 발현됨이 확인되었다. 이러한 결과는 매자나무 ethyl acetate 분획은 항산화 및 이와 관련된 질병에 대처하기 위한 자원으로서의 가치가 있을 것으로 사료된다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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