[논문]씀바귀 Ethyl acetate 분획물의 예쁜 꼬마선충 내의 항산화 효과

최지우; 김준형; 권강무; 황인현; 주남진; 김대근

doi:10.22889/kjp.2022.53.4.207

씀바귀 Ethyl acetate 분획물의 예쁜 꼬마선충 내의 항산화 효과
Antioxidant Activity of Ethyl acetate Fraction of Ixeris dentata (Thunb.) Nakai in Caenorhabditis elegans 원문보기

생약학회지, v.53 no.4, 2022년, pp.207 - 212

최지우 (우석대학교 식품생명공학과) , 김준형 (우석대학교 식품생명공학과) , 권강무 (우석대학교 약학과) , 황인현 (우석대학교 약학과) , 주남진 ((주)엔제이컴퍼니) , 김대근 (우석대학교 약학과)

Abstract ▼ AI-Helper

Through the Caenorhabditis elegans model system, the antioxidant activity of methanol extract of Ixeis dentata was investigated. The ethyl acetate soluble fraction of the I. dentata methanol extract showed the best DPPH radical scavenging activity. The ethyl acetate fraction was measured for the activity of superoxide dismutase (SOD), catalase, and oxidative stress tolerance by using C. elegans along with reactive oxygen species (ROS) level. In addition, to confirm that the regulation of the stress response gene is responsible for the increased stress tolerance of C. elegans treated by the ethyl acetate fraction, SOD-3 expression was measured using a transgenic strain (CF1553). As a result, the ethyl acetate fraction increased SOD and catalase activity, and decreased ROS accumulation in a dose-dependent manner. In addition, the ethyl acetate fraction-treated CF1553 worm showed higher SOD-3::GFP intensity than the control worm.

주제어

표/그림 (6)

$Fig. 1. DPPH radical scavenging effects of the methanol extract, and its fractions from I. dentata.$ 그림 Fig. 1. DPPH radical scavenging effects of the methanol extract, and its fractions from I. dentata.
$Fig. 2. Effects of ethyl acetate fraction of I. dentata on the antioxidant enzyme activity of wild-type N2 nematode. (A) The enzymatic reaction of xanthine with xanthine oxidase was used to generate •O2- and the SOD activity was estimated spectrophotometrically through formazan formation by NBT reduction. The SOD activity was showed as a percentage of superoxide-scavenged amount per control. (B) Catalase activity was calculated from the concentration of residual H2O2, as determined by a spectrophotometric method. The catalase activity was expressed in U/mg protein. Data are expressed as the mean ± S.E.M. of three independent experiments. Differences compared to the control were considered significant at **p<0.01 and ***p<0.001 by one-way ANOVA.$ 그림 Fig. 2. Effects of ethyl acetate fraction of I. dentata on the antioxidant enzyme activity of wild-type N2 nematode. (A) The enzymatic reaction of xanthine with xanthine oxidase was used to generate •O_2^- and the SOD activity was estimated spectrophotometrically through formazan formation by NBT reduction. The SOD activity was showed as a percentage of superoxide-scavenged amount per control. (B) Catalase activity was calculated from the concentration of residual H₂O₂, as determined by a spectrophotometric method. The catalase activity was expressed in U/mg protein. Data are expressed as the mean ± S.E.M. of three independent experiments. Differences compared to the control were considered significant at **p<0.01 and ***p<0.001 by one-way ANOVA.
$Fig. 3. Effects of ethyl acetate fraction of the I. dentata on the intracellular ROS levels of wild-type N2 nematodes. Intracellular ROS accumulation was examined in a microplate fluorescence reader at 535 nm (emission) and 485 nm (excitation). (A) Plates were read for 120 min. (B) The average percentages of intracellular ROS accumulation were presented. Differences compared with the control were considered significant at *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 by the one-way ANOVA.$ 그림 Fig. 3. Effects of ethyl acetate fraction of the I. dentata on the intracellular ROS levels of wild-type N2 nematodes. Intracellular ROS accumulation was examined in a microplate fluorescence reader at 535 nm (emission) and 485 nm (excitation). (A) Plates were read for 120 min. (B) The average percentages of intracellular ROS accumulation were presented. Differences compared with the control were considered significant at *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 by the one-way ANOVA.
$Fig. 4. Effects of ethyl acetate fractions of I. dentata on the stress tolerance of wild-type N2 nematodes. For the oxidative stress assays, worms were transferred to 96-well plate containing 1 mM of juglone liquid culture, and then their viability was scored. Statistical difference between the curves was analyzed by log-rank test.$ 그림 Fig. 4. Effects of ethyl acetate fractions of I. dentata on the stress tolerance of wild-type N2 nematodes. For the oxidative stress assays, worms were transferred to 96-well plate containing 1 mM of juglone liquid culture, and then their viability was scored. Statistical difference between the curves was analyzed by log-rank test.
$Fig. 5. Effect of ethyl acetate fraction of I. dentata on the expression of SOD-3 was determined using transgenic nematodes. (A) Images of SOD-3::GFP expression of CF1553 worm in the presence or absence of ethyl acetate fraction. (B) The mean GFP intensity of mutant was represented as mean ± S.E.M. of values from 19 to 25 animals per each experiment. The GFP intensity was quantified using Image software by determining average pixel intensity. Data are expressed as the mean ± standard deviation of three independent experiments. Differences compared with the control were considered significant at **p<0.01 and ***p<0.001 by one-way ANOVA.$ 그림 Fig. 5. Effect of ethyl acetate fraction of I. dentata on the expression of SOD-3 was determined using transgenic nematodes. (A) Images of SOD-3::GFP expression of CF1553 worm in the presence or absence of ethyl acetate fraction. (B) The mean GFP intensity of mutant was represented as mean ± S.E.M. of values from 19 to 25 animals per each experiment. The GFP intensity was quantified using Image software by determining average pixel intensity. Data are expressed as the mean ± standard deviation of three independent experiments. Differences compared with the control were considered significant at **p<0.01 and ***p<0.001 by one-way ANOVA.
$Table I. Effects of ethyl acetate fraction of Ixeis dentata on the oxidative stress tolerance of C. elegans$ 표 Table I. Effects of ethyl acetate fraction of Ixeis dentata on the oxidative stress tolerance of C. elegans

AI 본문요약
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문제 정의

형질 전환 선충 내 SOD-3의 발현 증가 효능 − 씀바귀 ethyl acetate 분획의 선충 내에서 oxidative stress에 저항하기 위한 단백질의 증가 여부를 확인하기 위해서 SOD발현 유전자의 증가 여부를 확인 하였다

제안 방법

추출 및 분획 − 씀바귀를 음건세절 후 얻은 시료 95 g을 methanol로 진탕하면서 5시간씩 50℃에서 2회 온침 추출하였다. 그 추출액을 수욕상에서 감압농축하여 methanol 엑스 약 21 g을 얻었으며, 이 methanol 엑스에 증류수로 현탁시키고 상법에 따라 동량의 n-hexane(5.3 g), methylene chloride (2.2 g), ethyl acetate(0.7 g) 및 n-butanol(3.5 g)의 순으로 용매 분획하여 각각의 분획물을 얻었다.

대상 데이터

실험재료 − 본 실험에 사용한 씀바귀는 전초를 2022년 8월에 완주군에서 채집 후 김대근 교수가 검증한 후에 음건 세절하여 사용하였으며, 표준품은 우석대학교 약학대학 생약표본실에 보관하고 있다(WS-22-007).

데이터처리

그룹간의 통계적 유의성 검정은 Student’s t-test를 통해서 분석하였고 선충의 연속적인 생존도는 Log-rank test 분석 방법을 이용하였다
통계 분석 − 통계 자료의 값은 평균값 ± 표준오차(mean ± S.E.M.)로 표시 하였다

성능/효과

2A에서 나타난 바와 같이 예쁜꼬마선충의 씀바귀 ethyl acetate 분획물 투여군은 SOD의 활성을 농도의존적으로 증가시켰으며, ethyl acetate 분획 500 μg/mL 투여군은 대조군과 비교 하여 SOD 활성을 약 23.7% 정도 증가시켰다(***p<0.001)
씀바귀 methanol 추출물의 분획물의 DPPH radical 소거 활성시험에서, ethyl acetate 분획이 가장 강한 소거활성을 보여 주었다. Eethyl acetate 분획은 선충 내의 항산화 효소인 SOD 및 catalase의 활성을 높이는 것으로 확인되었으며, juglone으로 처리하여 산화적 스트레스를 유도한 선충의 세포 내 활성 산소종의 수치를 확인한 결과 상당한 활성 산소종(ROS)의 축적억제 효능을 나타내었다. Juglone을 처리한 후 ethyl acetate 분획 처리가 선충의 stress 저항능력에 미치는 영향을 확인한 결과 oxidative stress 조건하에서 대조군과 비교하여 생존율이 농도 의존적으로 상당히 증가하는 것이 확인되었다.
Eethyl acetate 분획은 선충 내의 항산화 효소인 SOD 및 catalase의 활성을 높이는 것으로 확인되었으며, juglone으로 처리하여 산화적 스트레스를 유도한 선충의 세포 내 활성 산소종의 수치를 확인한 결과 상당한 활성 산소종(ROS)의 축적억제 효능을 나타내었다. Juglone을 처리한 후 ethyl acetate 분획 처리가 선충의 stress 저항능력에 미치는 영향을 확인한 결과 oxidative stress 조건하에서 대조군과 비교하여 생존율이 농도 의존적으로 상당히 증가하는 것이 확인되었다. 이와 관련하여, mutant(GFP-fused transgenic strain CL2070)를 이용하여 oxidative stress 저항성 단백질 발현 여부를 확인하는 실험에서는 형광 발현율이 상당히 증가함이 확인되어 oxidative stress에 저항할 수 있는 단백질의 발현이 증가되었음을 확인되었다.
SOD-3을 포함한 형질 전환 선충 CF1553을 사용하여 실험한 결과 CF1553 형질전환 선충에 ethyl acetate 분획의 500 μg/mL 처리군이 처리되지 않은 선충에 비해 높은 SOD-3::GFP 발현율(32.9%, ***p<0.001)을 보여 주었다(Fig
산화적 스트레스 저항성 증가 효능 − 씀바귀 ethyl acetate 분획의 juglone으로 산화적 스트레스를 유도한 선충의 생존율에 미치는 영향 평가실험에서 분획을 처리하지 않은 대조군 선충의 최고 생존시간은 36시간이었으나, ethyl acetate 분획 500 μg/mL 농도에서는 생존시간을 43시간으로 증가시켰다
씀바귀 ethyl acetate 분획은 DPPH free radical 소거실험에서 강한 항산화력을 나타냈으며, 예쁜꼬마선충을 이용한 항산화 실험에서는 SOD 및 catalase의 활성을 농도 의존적으로 높이는 것을 확인하였다. 선충 세포 내의 ROS의 발생을 농도의존적으로 감소시켰으며, juglone 투여로 유도한 산화적 스트레스 조건에서는 선충의 생존율을 농도 의존적으로 증가시켰다. 이와 관련하여 mutant인 GFP-fused transgenic strain CL2070을 이용한 산화적 스트레스 저항 단백질 발현 실험에서는 산화적 스트레스에 저항성이 있는 형광을 띤 단백질의 발현이 증가되었음이 확인되었다.
씀바귀 ethyl acetate 분획은 DPPH free radical 소거실험에서 강한 항산화력을 나타냈으며, 예쁜꼬마선충을 이용한 항산화 실험에서는 SOD 및 catalase의 활성을 농도 의존적으로 높이는 것을 확인하였다. 선충 세포 내의 ROS의 발생을 농도의존적으로 감소시켰으며, juglone 투여로 유도한 산화적 스트레스 조건에서는 선충의 생존율을 농도 의존적으로 증가시켰다.
씀바귀 methanol 추출물의 분획물의 DPPH radical 소거 활성시험에서, ethyl acetate 분획이 가장 강한 소거활성을 보여 주었다. Eethyl acetate 분획은 선충 내의 항산화 효소인 SOD 및 catalase의 활성을 높이는 것으로 확인되었으며, juglone으로 처리하여 산화적 스트레스를 유도한 선충의 세포 내 활성 산소종의 수치를 확인한 결과 상당한 활성 산소종(ROS)의 축적억제 효능을 나타내었다.
Juglone을 처리한 후 ethyl acetate 분획 처리가 선충의 stress 저항능력에 미치는 영향을 확인한 결과 oxidative stress 조건하에서 대조군과 비교하여 생존율이 농도 의존적으로 상당히 증가하는 것이 확인되었다. 이와 관련하여, mutant(GFP-fused transgenic strain CL2070)를 이용하여 oxidative stress 저항성 단백질 발현 여부를 확인하는 실험에서는 형광 발현율이 상당히 증가함이 확인되어 oxidative stress에 저항할 수 있는 단백질의 발현이 증가되었음을 확인되었다.

후속연구

이와 관련하여 mutant인 GFP-fused transgenic strain CL2070을 이용한 산화적 스트레스 저항 단백질 발현 실험에서는 산화적 스트레스에 저항성이 있는 형광을 띤 단백질의 발현이 증가되었음이 확인되었다. 이러한 결과를 볼 때 씀바귀 ethyl acetate 분획은 항산화 및 이와 관련된 질병의 예방 및 치료를 위한 천연자원으로서의 가치가 충분히 있을 것으로 사료된다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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