[논문]고초균-젖산균의 순차적 복합 발효를 통한 복합 기능성 물질 함유 황칠나무 추출물의 생산

손수진; 강혜미; 박윤호; 황보미향; 이삼빈

고초균-젖산균의 순차적 복합 발효를 통한 복합 기능성 물질 함유 황칠나무 추출물의 생산
Production of Dendropanax morbiferus extract containing multi-functional ingredients by serial fermentation using Bacillus subtilis HA and Lactobacillus plantarum KS2020

Food science and preservation, v.31 no.1, 2024년, pp.138 - 148

손수진 (계명대학교 식품가공학과) , 강혜미 (계명대학교 식품가공학과) , 박윤호 (계명대학교 식품가공학과) , 황보미향 (계명문화대학교 식품영양조리학부) , 이삼빈 (계명대학교 식품가공학과)

초록
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황칠나무 추출물의 순차적 복합발효를 통한 복합 기능성 물질들을 강화시킨 발효소재를 개발하였다. 황칠 추출물에 MSG와 glucose를 첨가한 후 1차 B. subtillis HA 발효를 통해 γ-PGA와 단백질 분해효소를 생성시켰다. 이후 skim milk와 glucose, yeast extract를 추가적으로 첨가하여 30℃에서 L. plantarum KS2020에 의한 2차 복합 발효를 통해서 기능성 물질인 GABA를 생산하였다. 황칠 추출물의 고초균 발효에서 생성된 점질물 및 점조도은 발효 2일 4.21±0.04 Pa·s, 4.1%±0.48%로 높은 점조도 값과 점질물을 함량을 보였다. pH 및 산도는 각각 8.9±0.01, 0.00±0.00이었으며 생균수는 7.27 log CFU/mL에서 발효 2일에 9.50 log CFU/mL로 높은 생균수를 보였다. 순차적 복합 발효가 진행되면서 고초균의 생균수는 4.30 log CFU/mL로 크게 감소하였으며 젖산균은 9.12 log CFU/mL로 증가하였다. Protease 활성 및 tyrosine 함량은 각각 0.8 unit/g, 57 mg%로 측정되었다. 이후 연속적 복합 발효 과정에서 발효 5일 차 106 mg% 정도로 증가되었으며, SDS-PAGE를 이용하여 casein 단백질이 분해된 것을 확인하였다. GABA 정성분석 결과 skim milk 5%만을 첨가한 조건을 제외하고 glucose, yeast extract가 추가로 첨가된 모든 조건에서 전구물질 MSG가 소진되면서 GABA로 전환되었다. 이중 최적 조건을 골라 정량분석을 진행하였으며 18.29 mg/mL의 GABA 함량을 나타내었다. 최종 황칠 복합 발효물은 γ-PGA, peptides, 고농도 GABA를 함유한 발효소재로써 다양한 식품의 원료 활용이 기대된다.

Abstract ▼ AI-Helper

The production of poly-γ-glutamic acid (γ-PGA) and γ-aminobutyric acid (GABA) was optimized by serial fermentation of Dendropanax morbiferus extract (DME) using Bacillus subtilis HA and Lactobacillus plantarum KS2020. The 1st alkaline fermentation was performed on 60% DME including 2% glucose and 10% monosodium ʟ-glutamate (MSG) as a precursor. The 1st fermented DME had 57 mg% tyrosine. Consequently, the 2nd lactic acid fermentation for 5 days increased the tyrosine content of 106 mg%. The mucilage containing γ-PGA showed a high content of 3.50% on the first day of alkaline fermentation and then increased to 4.10% after 2 days. The precursor (MSG) remaining in the 1st fermented DME was efficiently converted to GABA by the 2nd lactic acid fermentation in the presence of 5% skim milk, 1.5% glucose and 0.5% yeast extract, resulting in the production of 18.29 mg/mL GABA. The viable cells of lactic acid bacteria increased and indicated 9.49 log CFU/mL on the fermentation for 5 days, and the acidity of co-fermented DME indicated the highest value of 1.55%. Conclusively, the serial fermented DME has multi-functional ingredients containing γ-PGA, GABA, peptides and probiotics.

주제어

표/그림 (8)

그림 Fig. 1. Consistency index and mucilage content in DME fermented by Bacillus subtilis HA. n=3 for each group. Different letters (a-c) indicate significant difference at p<0.05 by Duncan's multiple range test.
그림 Fig. 2. Change of pH in DME co-fermented by Bacillus subtilis HA and L. plantarum KS2020. ¹⁾A: glucose 0%, ²⁾B: glucose 1.5%+YE 0%, ³⁾C: glucose 1.5%+YE 0.1%, 4)D: glucose 1.5%+ YE 0.5%. n=3 for each group. Different letters (a-g) indicate significant difference at p<0.05 by Duncan's multiple range test.
그림 Fig. 3. Acidity changes for DME co-fermented by Bacillus subtilis HA and L. plantarum KS2020. ¹⁾A: glucose 0%, ²⁾B: glucose 1.5%+YE 0%, ³⁾C: glucose 1.5%+YE 0.1%, ⁴⁾D: glucose 1.5%+YE 0.5%. n=3 for each group. Different letters (a-e) indicate significant difference at p<0.05 by Duncan's multiple range test.
그림 Fig. 4. Protease activity and tyrosine content for DME fermented by Bacillus subtilis HA and tyrosine content of DME co-fermented by L. plantarum KS2020. ¹⁾A: glucose 0%, ²⁾B: glucose 1.5%+YE 0%, ³⁾C: glucose 1.5%+YE 0.1%, ⁴⁾D: glucose 1.5%+YE 0.5%. n=3 for each group. Different letters (a-g) indicate significant difference at p<0.05 by Duncan's multiple range test.
그림 Fig. 5. Viable bacterial count for DME co-fermented by Bacillus subtilis HA and L. plantarum KS2020. ¹⁾A: glucose 0%, ²⁾B: glucose 1.5%+YE 0%, ³⁾C: glucose 1.5%+YE 0.1%, ⁴⁾D: glucose 1.5%+YE 0.5%. n=3 for each group. Different letters (a-d) indicate significant difference at p<0.05 by Duncan's multiple range test.
그림 Fig. 6. TLC of DME by Bacillus subtilis HA and L. plantarum KS2020. ¹⁾A: glucose 0%, ²⁾B: glucose 1.5%+YE 0%, ³⁾C: glucose 1.5%+YE 0.1%, ⁴⁾D: glucose 1.5%+YE 0.5%.
그림 Fig. 7. SDS-PAGE pattern of co-fermented DME. ¹⁾A: glucose 0%, ²⁾B: glucose 1.5%+YE 0%, ³⁾C: glucose 1.5%+YE 0.1%, ⁴⁾D:
표 Table 1. Change in GABA contents of co-fermented DME using HPLC

AI 본문요약
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제안 방법

1차 고초균 발효물에 멸균된 skim milk 5%, glucose 1.5% 및 yeast extract 0%, 0.1%, 0.5%(w/v)를 추가적으로 첨가한 후 L. plantarum KS2020 스타터 1%(w/v)를 접종하여 항온배양기에서 30℃로 5일간 정치 배양하였다.
DME(60%)은 121℃, 15분간 고압증기 멸균시킨 후 멸균된 50% glucose 및 50% MSG 용액(w/v)을 각각 2%(v/v), 10%(v/v)가 되도록 첨가하였다. 5% skim milk 배지에서 배양한 B.
MSG 및 GABA의 정성분석은 silica gel TLC plate(10×20 cm)를 활용한 Thin Layer Chromatography(TLC) 사용하여 분석하였다
5%(w/v)를 추가적으로 첨가한 후 L. plantarum KS2020 스타터 1%(w/v)를 접종하여 항온배양기에서 30℃로 5일간 정치 배양하였다.
5% skim milk 배지에서 배양한 B. subtilis HA 스타터 5%(v/v)를 접종하여 진탕배양기에서 42℃, 160 rpm으로 2일 동안 진탕 배양한 후 발효물의 이화학적 분석을 하였다.
복합 발효시킨 황칠 추출액 발효물의 단백질 가수분해 정도를 확인하기 위해 sodium dodecyl sulfate polyacylamide gel(SDS-PAGE) 전기영동(Hofer Scientific Instrument, CA)을 수행하였다(Yoon, 2019). 발효물을 15,000 rpm에서 15분간 원심분리한 후, SDS-sample buffer(×5, 0.
9, acidity 0%로 pH는 증가하였으며 잔존하는 유기산이 없는 것으로 나타났다. 순차적 복합 발효를 위해서 1차 고초균 발효물에 skim milk를 5% 혼합한 후 추가적으로 포도당과 yeast extract를 첨가하지 않은 조건(A)과 포도당 1.5%에 yeast extract를 각각 0, 0.1%, 0.5% 농도별로 첨가한 B, C, D 조건에서 2차 젖산균 발효를 수행하였다.
순차적 복합발효 동안 1차 고초균 발효물에 잔존하는 MSG로부터 GABA 전환을 Thin Layer Chromatography를 통해 확인하였다. 1차 고초균 발효물에 추가적으로 포도당이 무 첨가된 경우에 2차 젖산균 복합발효 7일 차가 되도록 MSG가 GABA로의 전환이 미비하였다(Fig.
용매는 n-butyl alcohol:acetic acid glacial: distilled water를 3:1:1로 혼합한 후 2시간 이상 포화시켰다. 전개 후 TLC plate는 100℃ 감압건조기에서 건조한 후 0.2% ninhydrin 발색 시약 용액을 뿌려 100℃에서 5분 정도 발색시켜 MSG와 GABA의 spot을 확인하였다.
황칠 복합 발효물의 단백질 분해산물인 펩타이드의 생성정도를 비교하기 위해서 tyrosine 함량을 측정하였다. 고초균 발효시에 초기에 41.
황칠 복합 발효중에 첨가된 탈지분유 단백질의 가수분해 정도를 SDS-PAGE 전기영동을 통해 확인하였다(Fig. 7).

대상 데이터

Bacillus subtilis HA(KCCM 10775P) 균주는 청국장에서 분리한 후 기탁한 한국미생물보존센터로부터 분양받아 1차 고초균 발효에 사용하였다. 5% skim milk broth에 MRS 고체배지에서 배양된 고초균 한 colony를 접종하여 42℃에서 24시간 160 rpm으로 진탕배양 후 B.
100℃에서 5분간 가열하여 gradient SDS-PAG(5-13%, O-RAD, Seoul, Korea)에 시료를 10 μL 주입한 후 전기 영동하였다. Gel의 염색은 Instant Blue 용액(Expedeon Ltd., Cambridgeshire, UK)을 사용하였으며, standard는 0.5% skim milk 용액, 표준 단백질은 10 kDa, 15 kDa, 25 kDa, 35 kDa, 40 kDa, 55 kDa, 70 kDa, 130 kDa, 170 kDa으로 조합되어 있는 marker 단백질(Thermo scientific, Waltham, MA, USA)을 사용하였다.
5% skim milk broth에 MRS 고체배지에서 배양된 고초균 한 colony를 접종하여 42℃에서 24시간 160 rpm으로 진탕배양 후 B. subtilis HA를 스타터로 사용하였다.

데이터처리

실험결과는 Statistical Package for the Social Science(SPSS, Version 27.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 평균(n=3)과 표준편차(mean±SD)를 구하였으며, 각 집단 간 평균치 차이를 검증하기 위하여 one way-ANOVA 및 Duncan’s multiple range test를 적용하였다

성능/효과

순차적 복합발효 동안 1차 고초균 발효물에 잔존하는 MSG로부터 GABA 전환을 Thin Layer Chromatography를 통해 확인하였다. 1차 고초균 발효물에 추가적으로 포도당이 무 첨가된 경우에 2차 젖산균 복합발효 7일 차가 되도록 MSG가 GABA로의 전환이 미비하였다(Fig. 6(A)).
이는 황칠 추출물이 높은 페놀화합물의 함량으로 발효 초기 높은 tyrosine 함량 값으로 나타난 것으로 판단된다. 2차 젖산균에 의한 복합 발효가 진행될 때 추가적인 영양성분 첨가로 인해 1차 발효물이 희석됨에 따라 tyrosine 함량이 조금 감소한 후 완만하게 증가하는 경향을 나타내었다. A 조건의 경우 복합 발효 5일 차 107.
B, C, D 조건의 경우 연속적 복합 발효 3일 차에 대부분의 MSG가 소진되면서 GABA로 전환되는 것으로 나타났다 (Fig. 6(B)-(D)) 하지만 발효 1일 차 spot을 볼 때 yeast extract 함량이 높을수록 발효 속도가 빨라지는 것을 확인하였다.
2차 젖산균에 의한 복합 발효가 진행될 때 추가적인 영양성분 첨가로 인해 1차 발효물이 희석됨에 따라 tyrosine 함량이 조금 감소한 후 완만하게 증가하는 경향을 나타내었다. A 조건의 경우 복합 발효 5일 차 107.74 mg%로 증가되었으며 B, C, D 조건에서도 유사한 값을 보였다. 따라서 2차 젖산균 발효시에 첨가되는 yeast extract에 농도 의존성은 없는 것으로 나타났다.
6(A)). B, C, D 조건의 경우 연속적 복합 발효 3일 차에 대부분의 MSG가 소진되면서 GABA로 전환되는 것으로 나타났다 (Fig. 6(B)-(D)) 하지만 발효 1일 차 spot을 볼 때 yeast extract 함량이 높을수록 발효 속도가 빨라지는 것을 확인하였다.
7%를 나타내었다. Yeast extract가 무 첨가된 조건 B는 pH 8.30, 산도 0.15%에서 발효 5일 차에는 pH 5.20, 산도 1.6%로 증가하였다. 포도당 1.
젖산균 복합 발효가 진행되면서 네 조건 모두 발효 초기 L. plantarum KS2020의 생균수는 7.23 log CFU/mL에서 시작하여 발효 5일 차에 A조건은 9.56 log CFU/mL, B조건은 9.34 log CFU/mL, C조건은 9.85 log CFU/mL, D조건은 9.77 log CFU/mL으로 모두 높은 값을 나타내었다(Fig. 5).
황칠 추출물의 고초균 발효물에서 B. subtilis HA의 생균수는 발효 초기 7.27 log CFU/mL로 측정되었으며, 발효 2일 차 9.50 log CFU/mL까지 크게 증가하였다. 순차적 복합 발효과정에서 크게 감소하면서 발효 5일 차에 고초균은 4.
황칠 복합 발효물의 단백질 분해산물인 펩타이드의 생성정도를 비교하기 위해서 tyrosine 함량을 측정하였다. 고초균 발효시에 초기에 41.72 mg%에서 발효 2일 차에 57.23 mg%로 증가하였다. 발효 0일 차에 높은 함량의 tyrosine 함량이 측정되었다.
동일한 고초균과 젖산균을 이용하여 수행된 옻 추출물의 복합 발효 5일 차에서 124.40 mg%의 tyrosine 함량을 보고(Kang, 2022) 하였으며, 본 연구의 황칠 추출물의 복합발효물의 최적 조건에서 tyrosine 함량이 106.55 mg%로 약간 낮은 값을 보였다. 이는 1차 고초균 발효 중에 생성된 단백질 분해효소에 의해서 우유 단백질 가수분해가 진행되었으며, yeast extract 첨가에 관계없이 2차 젖산균에 의한 복합 발효동안 완만하게 증가하는 경향을 보였다.
74 mg%로 증가되었으며 B, C, D 조건에서도 유사한 값을 보였다. 따라서 2차 젖산균 발효시에 첨가되는 yeast extract에 농도 의존성은 없는 것으로 나타났다.
7). 따라서 연속적 복합 발효과정에서 첨가된 포도당 및 yeast extract에 관계없이 1차 고초균 발효에 의해서 생성된 단백질 분해효소가 2차 젖산균 복합 발효시에 첨가된 탈지분유의 카세인 단백질을 분해시켜 10 kDa 이하의 펩타이드로 저분자화시키는 것으로 나타났다.
23 mg%로 증가하였다. 발효 0일 차에 높은 함량의 tyrosine 함량이 측정되었다. 이는 황칠 추출물이 높은 페놀화합물의 함량으로 발효 초기 높은 tyrosine 함량 값으로 나타난 것으로 판단된다.
본 연구에서 황칠 고초균 발효물에 첨가한 우유 단백질이 젖산균 복합 발효 1일 차에 저분자 펩타이드로의 전환이 빠르게 이루어지며, 발효 3일 차 이후에는 펩타이드의 분자량 감소로 gel 상에 밴드가 확인되지 않음을 확인하였다(Fig. 7).
50 log CFU/mL까지 크게 증가하였다. 순차적 복합 발효과정에서 크게 감소하면서 발효 5일 차에 고초균은 4.30 log CFU/mL로 나타났다. 이는 2차 젖산균 발효과정에서 생성된 유기산 등의 대사산물과 관련이 있으며, 산성 조건에서 고초균의 생육이 억제되고 일부 사멸하는 것으로 판단된다.
옻 추출물에 동일한 고초균과 젖산균을 이용하여 1차 고초균 발효물에서 고초균의 생균수는 발효 2일 차에 8.8 log CFU/mL까지 증가하였고, 연속적 복합 발효가 진행되면서 7.68 log CFU/mL로 감소하였다. 반면에 젖산균을 이용한 2차 발효과정에서 젖산균의 생균수는 최종 발효물에서 9.
옻 추출물에 동일한 고초균과 젖산균을 이용하여 발효시킨 복합 발효물의 생산과정에서 약 1.79% 정도의 GABA가 생성됨을 보고(Kang, 2022)하였으며, 최종 황칠 추출물 복합 발효물도 약 1.829% 정도의 높은 GABA를 포함하였다.
55 mg%로 약간 낮은 값을 보였다. 이는 1차 고초균 발효 중에 생성된 단백질 분해효소에 의해서 우유 단백질 가수분해가 진행되었으며, yeast extract 첨가에 관계없이 2차 젖산균에 의한 복합 발효동안 완만하게 증가하는 경향을 보였다.
30 log CFU/mL로 나타났다. 이는 2차 젖산균 발효과정에서 생성된 유기산 등의 대사산물과 관련이 있으며, 산성 조건에서 고초균의 생육이 억제되고 일부 사멸하는 것으로 판단된다.
황칠나무 추출물 배지에서 고초균의 액상발효를 통한 점질물 생산은 매우 높은 것으로 판단된다. 이는 아미노산 영양원으로 첨가된 전구물질인 MSG가 10% 수준으로 기존의 액상발효보다 높은 농도가 사용된 결과로 판단된다. 고분자 점질물에 포함된 γ-PGA 생산은 전구물질 MSG로부터 고초균의 세포내 합성 효소들에 의해서 고분자물질로 생합성되어 세포외로 분비되는 것으로 보고되었다(Luo et al.
6(D)). 이는 황칠 추출물을 이용한 고초균 및 젖산균 복합발효를 수행할 때 1차 고초균 발효물에 추가적으로 포도당 1.5%, yeast extract 0.5%를 첨가하여 2차 젖산균 발효를 수행하는 것이 GABA를 효과적으로 생성하는 최적 조건인 것으로 판단된다.
젖산균 발효 0일 차 조건 A는 pH 8.3, 산도 0.1%를 보였고, 발효 5일 차에는 유기산 생성으로 pH 5.1, 산도 1.7%를 나타내었다. Yeast extract가 무 첨가된 조건 B는 pH 8.
12 log CFU/mL까지 증가됨을 보고하였다(Kang, 2022). 천연물로서 옻 추출물과 유사한 용도로 사용되는 황칠 추출물을 이용한 고초균과 젖산균의 복합 발효시에 젖산균의 생균수가 옻 추출물 발효물 보다 더 높은 생균수를 보였다.
천연물에 존재하는 발효성당이 젖산균 발효를 통해서 젖산의 생성으로 발효물의 산도가 증가하는 것처럼, 황칠나무 추출물의 2차 젖산균 발효과정에서 발효 1일에 산도가 0.5% 수준으로 증가한 후 발효 5일까지 급격하게 증가하여 1.6% 정도 산도를 나타내었다. 황칠 추출물의 순차적 복합발효가 진행될수록 네 가지 조건 모두 pH는 감소하여 pH 5.
6%로 증가하였다. 포도당 1.5%에 추가적으로 yeast extract 0.1%, 0.5% 첨가된 조건 C, D는 pH 8.1, 산도 0.1%에서 발효 5일 차에는 pH 5.2와 산도 1.55%-1.59%로 유사한 값을 나타내었다.
7). 황칠 고초균 발효물을 젖산균 복합 발효한 A, B, C, D 모든 조건에서 카세인 단백질이 가수분해되어 저분자화된 것으로 나타났다. 이는 고초균 발효물에 존재하는 단백질 분해효소에 의해서 기질인 우유 단백질이 가수분해되는 것으로 사료된다.
5%)의 glutamic acid및 GABA 함량은 다음과 같다. 황칠 복합 발효 7일 차에 발효물의 glutamic acid는 0.44 mg/mL이었으며, GABA는 18.29 mg/mL를 나타내었다(Table 1).
황칠 추출물을 이용한 1차 고초균 발효과정에서 발효 0일 차 protease 활성은 검출되지 않았으며, 발효 1일 차 0.68 unit/g으로 protease 활성을 나타내었으며, 발효 2일 차 0.8 unit/g으로 유사한 값을 보였다(Fig. 4).
옻 추출물 고초균 및 젖산균 복합 발효물의 GABA 정성실험에서도 복합 발효 3일 차부터 MSG 잔존 없이 GABA로 완전히 전환된 것을 보고 하였다(Kang, 2022). 황칠 추출물의 복합 발효물 생산 최적 조건(D)에서 젖산균 발효 1일 차부터 GABA 전환이 시작하여 3일 차에는 MSG 잔존없이 GABA로 전환된 것으로 나타났다(Fig. 6(D)).
6% 정도 산도를 나타내었다. 황칠 추출물의 순차적 복합발효가 진행될수록 네 가지 조건 모두 pH는 감소하여 pH 5.2를 보였으며, 산도는 크게 증가하여 1.5% 이상의 높은 값을 보였다(Fig. 2, 3).
27% 수준으로 보고되었다(Yoon, 2019). 황칠나무 추출물 배지에서 고초균의 액상발효를 통한 점질물 생산은 매우 높은 것으로 판단된다. 이는 아미노산 영양원으로 첨가된 전구물질인 MSG가 10% 수준으로 기존의 액상발효보다 높은 농도가 사용된 결과로 판단된다.
황칠나무 추출물의 고초균 발효 0일 차 발효물은 pH 7.6, acidity 0%에서 2일 차 pH 8.9, acidity 0%로 pH는 증가하였으며 잔존하는 유기산이 없는 것으로 나타났다. 순차적 복합 발효를 위해서 1차 고초균 발효물에 skim milk를 5% 혼합한 후 추가적으로 포도당과 yeast extract를 첨가하지 않은 조건(A)과 포도당 1.

후속연구

이러한 황칠 추출물에 고초균과 젖산균의 순차적 복합 발효를 통한 GABA, probiotics, γ- PGA, peptides 등의 기능성 물질들이 강화된 황칠 추출물 발효액을 제조함으로써 다양한 기능성 소재로 활용 가능한 차별화된 황칠 발효 소재 개발이 필요하다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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