Kim, Jung-Jae
(Department of Orthopedic Surgery, Asan Medical Center, Ulsan University College of Medicine, Seoul, Korea.)
,
Shon, Hyun-Chul
(Department of Orthopedic Surgery, Chungbuk National University College of Medicine, Cheongju, Korea.)
,
Chang, Jae-Suk
(Department of Orthopedic Surgery, Asan Medical Center, Ulsan University College of Medicine, Seoul, Korea.)
,
Kim, Jung-Hwa
(Department of Orthopedic Surgery, Asan Medical Center, Ulsan University College of Medicine, Seoul, Korea.)
,
Lee, Kang-Sik
(Department of Orthopedic Surgery, Asan Medical Center, Ulsan University College of Medicine, Seoul, Korea.)
,
Kim, Seok-Won
(Department of Orthopedic Surgery, Chungbuk National University College of Medicine, Cheongju, Korea.)
목적: 저산소 분압에서의 세포 배양과 백서 골절 모델을 통하여 연골세포와 조골세포의 HIF-1α와 HIF-2α 및 VEGF의 발현과 기전에 대해서 알아보고자 하였다.
재료 및 방법: DME/F12 배양액을 95% N₂와 5% CO₂의 혼합가스처리로 산소분압을 60 ㎜Hg 이하로 만들고, 이를 사람의 뼈와 관절연골에서 추출해서 배양중인 조골세포와 연골세포 그리고 백서의 골수기질세포인 ST2세포에 첨가하였다. 2, 6, 24시간 후 total RNA와 단백질을 추출하여 HIF-lα, HIF-2α, VEGF의 발현에 대해 RT-PCR 및 Western blot analysis를 통하여 확인하였다. 백서의 대퇴골을 골절시키고 3, 5, 7, 10, 14, 21일 경과 후 가골을 채취하여 Western blot analysis와 RT-PCR를 통해 HIF-1α와 VEGF의 발현을 관찰하였다.
결과: 저산소 분압 상태의 조골세포와 연골세포에 대해 RT-PCR을 실시한 결과, HIF-1α, HIF-2α는 정상군과 큰 차이가 없었으나, VEGF는 정상군보다 현저히 증가되었다. Western blot analysis에서는 저산소 분압 상태에서 정상군보다 HIF-1α, HIF-2α의 발현이 크게 증가하였다. siRNA로 HIF를 억제한 결과 HIP뿐 아니라 VEGF의 발현도 감소하였다. 백서의 가골에서 HIF-1α와 VEGF의 발현을 분석한 결과 골절 후 5일에서 7일까지 최대치를 보이다가 10일 이후 급격하게 감소하였다.
결론: 골모세포와 연골세포는 저산소 상태에서 HIF 단백이 증가하였는데 이는 post-translational modification에 의하여 이루어지는 반면, 가골에서는 저산소증 뿐만 아니라 성장 인자와 같은 다른 인자에 의해 조절받아 HIF의 mRNA 발현이 증가된다고 판단된다. 향후 가골에서 저산소 이외에 작용하는 인자들을 밝히는 연구가 필요할 것으로 생각된다.
목적: 저산소 분압에서의 세포 배양과 백서 골절 모델을 통하여 연골세포와 조골세포의 HIF-1α와 HIF-2α 및 VEGF의 발현과 기전에 대해서 알아보고자 하였다.
재료 및 방법: DME/F12 배양액을 95% N₂와 5% CO₂의 혼합가스처리로 산소분압을 60 ㎜Hg 이하로 만들고, 이를 사람의 뼈와 관절연골에서 추출해서 배양중인 조골세포와 연골세포 그리고 백서의 골수기질세포인 ST2세포에 첨가하였다. 2, 6, 24시간 후 total RNA와 단백질을 추출하여 HIF-lα, HIF-2α, VEGF의 발현에 대해 RT-PCR 및 Western blot analysis를 통하여 확인하였다. 백서의 대퇴골을 골절시키고 3, 5, 7, 10, 14, 21일 경과 후 가골을 채취하여 Western blot analysis와 RT-PCR를 통해 HIF-1α와 VEGF의 발현을 관찰하였다.
결과: 저산소 분압 상태의 조골세포와 연골세포에 대해 RT-PCR을 실시한 결과, HIF-1α, HIF-2α는 정상군과 큰 차이가 없었으나, VEGF는 정상군보다 현저히 증가되었다. Western blot analysis에서는 저산소 분압 상태에서 정상군보다 HIF-1α, HIF-2α의 발현이 크게 증가하였다. siRNA로 HIF를 억제한 결과 HIP뿐 아니라 VEGF의 발현도 감소하였다. 백서의 가골에서 HIF-1α와 VEGF의 발현을 분석한 결과 골절 후 5일에서 7일까지 최대치를 보이다가 10일 이후 급격하게 감소하였다.
결론: 골모세포와 연골세포는 저산소 상태에서 HIF 단백이 증가하였는데 이는 post-translational modification에 의하여 이루어지는 반면, 가골에서는 저산소증 뿐만 아니라 성장 인자와 같은 다른 인자에 의해 조절받아 HIF의 mRNA 발현이 증가된다고 판단된다. 향후 가골에서 저산소 이외에 작용하는 인자들을 밝히는 연구가 필요할 것으로 생각된다.
Purpose: To elucidate the relation between fracture healing and angiogenesis, we checked expression of Hypoxia-inducible factor (HIF) and Vascular endothelial growth factor (VEGF) in hypoxic cell cultures and the callus from a rat femur fracture model. Materials and Methods: Human osteoblasts, chond...
Purpose: To elucidate the relation between fracture healing and angiogenesis, we checked expression of Hypoxia-inducible factor (HIF) and Vascular endothelial growth factor (VEGF) in hypoxic cell cultures and the callus from a rat femur fracture model. Materials and Methods: Human osteoblasts, chondrocytes, and rat ST2 cells were cultured in DME/F12 media with 10% FBS. Hypoxic DME/F12 media (PO₂＜60 ㎜Hg) was generated by bubbling with 95% N2 and 5% CO₂ and added to cells. After 2, 6, and 24 hours, RNA and proteins were collected for reverse transcription - polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blot. In addition, immunocytochemistry and siRNA treatment for HIF-1α were performed. Next, femurs from 9-week SD rats were fractured after fixation with needles. The rats were sacrificed at post-fracture day (PFD) 3, 5, 7, 10, 14, 21 and calluses were collected for RT-PCR and Western blot. Results: HIF-1α and HIF-2α expression were not increased in RT-PCR but protein levels were increased. VEGF expression in RT-PCR was increased. Treatment with siRNA directed towards HIF inhibited VEGF expression. In the rat fracture callus, HIF-1α and VEGF expression peaked between PFD 5 and 7 and decreased after PFD 10. In contrast to cell culture, mRNA expression of HIF-1α was increased at PFD 7. Conclusion: HIF-1α and VEGF peaked early in fracture healing. With expression decreasing as O₂ tension increased. Further study is needed to identify other factors affecting chondrogenic differentiation.
Purpose: To elucidate the relation between fracture healing and angiogenesis, we checked expression of Hypoxia-inducible factor (HIF) and Vascular endothelial growth factor (VEGF) in hypoxic cell cultures and the callus from a rat femur fracture model. Materials and Methods: Human osteoblasts, chondrocytes, and rat ST2 cells were cultured in DME/F12 media with 10% FBS. Hypoxic DME/F12 media (PO₂＜60 ㎜Hg) was generated by bubbling with 95% N2 and 5% CO₂ and added to cells. After 2, 6, and 24 hours, RNA and proteins were collected for reverse transcription - polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blot. In addition, immunocytochemistry and siRNA treatment for HIF-1α were performed. Next, femurs from 9-week SD rats were fractured after fixation with needles. The rats were sacrificed at post-fracture day (PFD) 3, 5, 7, 10, 14, 21 and calluses were collected for RT-PCR and Western blot. Results: HIF-1α and HIF-2α expression were not increased in RT-PCR but protein levels were increased. VEGF expression in RT-PCR was increased. Treatment with siRNA directed towards HIF inhibited VEGF expression. In the rat fracture callus, HIF-1α and VEGF expression peaked between PFD 5 and 7 and decreased after PFD 10. In contrast to cell culture, mRNA expression of HIF-1α was increased at PFD 7. Conclusion: HIF-1α and VEGF peaked early in fracture healing. With expression decreasing as O₂ tension increased. Further study is needed to identify other factors affecting chondrogenic differentiation.
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