[논문]동결 건조법을 이용한 레트로바이러스 저장의 안정화에 미치는 trehalose의 영향

조수형; 김병기

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조수형 (서울대학교 공과대학 생물화학공학 협동과정, 서울대학교 유전공학연구소 분자생물공학 및 생물신소재 실험실) , 김병기 (서울대학교 공과대학 생물화학공학 협동과정, 서울대학교 유전공학연구소 분자생물공학 및 생물신소재 실험실)

레트로바이러스를 동결 건조과정에서 발생하는 물리적, 화학적인 스트레스로 인한 바이러스의 실활을 보완하기 위해 첨가하여 준 여러 가지 첨가물 중 trehalose가 가장 탁월한 protectant임을 알 수 있었고 최적 첨가농도는 300mM이었다. Trehalose의 역할을 보완하기 위하여 분자량이 큰 polymer들을 첨가 하였으나 trehalose만을 넣어 주었을 때 보다 poly(vinylpyrollidone)(PVP)의 경우 큰 영향은 볼수 없었고 dextran과 PEG를 첨가 하였을 경우엔 오히려 더욱 활성이 감소하였다.

We investigated the effect of various additives on the freeze-drying efficiency of recombinant retrovirus. Trehalose was the more effective protectant compared with sucrose or glucose and the optimize trehalose concentration was 300 mM. To improve the effect of trehalose, trehalose-polymers mixtures were tested as protectants so that Poly(vinylpyrollidon)(PVP) improved the recovery yield slightly, but dextran and Poly(ethylenglycol)(PEG) showed a negative effect.

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문제 정의

하지만 레트로바이러스가 동결 건 조공정을 거치는 동안 안정성이 떨어져 이를 보안하는 방법이 필요하게 되었다. 따라서, 종전의 단백질 동결 건조에 이용되는 여러가지 당을 비롯한 고분자 물질들 을 사용하여 레트로바이러스의 freezing이나 dehydration 과정동안 발생하는 실활을 최소화하는 연구를 수행하게 되었다.

제안 방법

5 ml을 넣어주었다. 24시간 후, 0.5% glutaraldehyde용액으로 세포를 고정시키고 X-gal용액으로 염색한 후, 염색된 세포 수를 측정하였다.
동결 건조시 레트로바이러스의 활성을 유지시키기 위한 첨가물을 탐색하고자 효소 나 단백질의 freeze-drying에 사용이 되고 있는 trehalose, sucrose, glucose# 동결 건조 과정동안 첨가하였다(Fig.l). 이 중 trehalose를 첨가한 경우 -70℃ 에 보관한 레트로바이러스와 비교하여 72%의 활성을 나타내었으며 첨가하지 않고 동결 건조 시킨 경우와는 약 2배의 활성을 나타내었다.
따라서 이 결과로 Tg와 더불어 건조 상태에서 당과 레트로바이러스간의 직접적인 상호작용이 레트로바이러스의 활성을 보존해 준 다는 것을 알 수 있었다. 따라서 trehalose와 높은 Tg값을 갖는 분자량이 큰 protectant# 동시에 첨가하였을 경우七 레트로바이러스의 동결 건조 후 활성에 미치는 영향을 일-아보기 위해 dextran, Poly (vinylpyrrolidone)(PVP), Poly(ethylenglycol)(PEG)를 첨가해 보았다. (Fig.
레트로바이 러스의 동결 건조시 레트로바이러스 20人와 각각의 첨가물 20人를 혼합 해 준 후, -70℃에서 12시간 동안 동결시키고 4~6 Torr의 압력의 동결 건조기에서 24시간동안 건조시겼다.

대상 데이터

레트로바이러스의 생산을 위해서 CRIP/MFG-LacZ 세포를 사용하였고, 바이러스 정 량을 위한 감염세포로는 NIH-3T3를 사용하였다. 세포의 계대 배양을 위하여 10%(v/v) calf serum이 포함된 DMEM을 사용하였고 5% C₆와 37℃에서 배양하였다.
레트로바이러스의 생산을 위해서 CRIP/MFG-LacZ 세포를 사용하였고, 바이러스 정 량을 위한 감염세포로는 NIH-3T3를 사용하였다. 세포의 계대 배양을 위하여 10%(v/v) calf serum이 포함된 DMEM을 사용하였고 5% C₆와 37℃에서 배양하였다. 레트로바이러스를 생산하는 세포인 CRIP/MFG-LacZ 를 10% calf serum이 포함된 DMEM배지에서 confluence하게 배양하여 상등액을 얻기 24시간 전에 새로운 배지로 교환하고 상등액을 0.

성능/효과

Trehalose에 10% PVP를 첨가 했을 때 trehalose만을 첨가하였을 경우와 비교하여 약 2%의 활성이 증가하였으나 그 이상의 농도에서는 오히려 활성이 감소하였다. PVP 가 가장 좋은 활성도를 나 타냈으나 tr하lalose에 비해 레트로바이러스의 활성에 큰 영향을 끼치지는 못했고 다른 protectnant의 경우 모두 trehalose보다 레트로바이러스의 활성에 저조함을 나타 냈다. 이렇게 trehalose의 protectant로서 안정성을 확인한 후 레트로바이러스의 동 결 건조시 이의 농도를 변화시켜 첨가해 주어 300mM일 때 가장 높은 활성을 나타 냄을 확인할 수 있었다 (Fig.
2). Trehalose에 10% PVP를 첨가 했을 때 trehalose만을 첨가하였을 경우와 비교하여 약 2%의 활성이 증가하였으나 그 이상의 농도에서는 오히려 활성이 감소하였다. PVP 가 가장 좋은 활성도를 나 타냈으나 tr하lalose에 비해 레트로바이러스의 활성에 큰 영향을 끼치지는 못했고 다른 protectnant의 경우 모두 trehalose보다 레트로바이러스의 활성에 저조함을 나타 냈다.
2 고분자 물질은 비 록 높은 Tg 값을 가졌지만 그들의 steric limitation 때문에 레트로바이러스와의 안 정화에 큰 영향을 끼치지 못한다. 따라서 이 결과로 Tg와 더불어 건조 상태에서 당과 레트로바이러스간의 직접적인 상호작용이 레트로바이러스의 활성을 보존해 준 다는 것을 알 수 있었다. 따라서 trehalose와 높은 Tg값을 갖는 분자량이 큰 protectant# 동시에 첨가하였을 경우七 레트로바이러스의 동결 건조 후 활성에 미치는 영향을 일-아보기 위해 dextran, Poly (vinylpyrrolidone)(PVP), Poly(ethylenglycol)(PEG)를 첨가해 보았다.
레트로바이러스를 동결건조과정에서 발생하는 물리적, 화학적인 스트레스로 인한 바이러스의 실활을 보완하기 위해 첨가하여 준 여러 가지 첨가물 중trehalose가 가장 탁월한 protectant임을 알 수 있었고 최적 첨가 농도는 300mM이었다. Trehalose 의 역할을 보완하기 위하여 분자량이 큰 polymer들을 첨가하였으나 trehalose만 을 넣어주었을 때보다 poly(vinylpyrollidone)(PVP)의 경우 큰 영향은 볼 수 없었고 dextran과 PEG를 첨가하였을 경우엔 오히려 더욱 활성이 감소하였다.
PVP 가 가장 좋은 활성도를 나 타냈으나 tr하lalose에 비해 레트로바이러스의 활성에 큰 영향을 끼치지는 못했고 다른 protectnant의 경우 모두 trehalose보다 레트로바이러스의 활성에 저조함을 나타 냈다. 이렇게 trehalose의 protectant로서 안정성을 확인한 후 레트로바이러스의 동 결 건조시 이의 농도를 변화시켜 첨가해 주어 300mM일 때 가장 높은 활성을 나타 냄을 확인할 수 있었다 (Fig. 3). Trehalose가 동결 건조시 레트로바이러스의 안정 성에 큰 역할을 하는 이유는 비슷한 분자량임에도 불구하고 sucrose보다 높은 T;를 가지고 있고 건조과정에서 물대신 단백질이나 인지질 막과 수소 결합을 대체하는 능력이 다른 당 보다 우수하기 때문이다.
전체적인 실험에서 -70℃에서 저장한 경우보다 동결건조법을 이용한 저장 방법이 활성도에 있어서 20% 정도 저조한 것을 볼 수 있다. 이는 저온에서의 냉동과 고압 으로 탈수하는 과정에서 생기는 물리적, 화학적인 스트레스로 인한 실활 이라고 볼 수 있는데 이를 개선하기 위해 앞으로 freezing programming2] 조절이나 건조 시 수분의 양의 최적화등 실험조건들을 보완한다면 이를 극복할 수 있을 것이다.

후속연구

전체적인 실험에서 -70℃에서 저장한 경우보다 동결건조법을 이용한 저장 방법이 활성도에 있어서 20% 정도 저조한 것을 볼 수 있다. 이는 저온에서의 냉동과 고압 으로 탈수하는 과정에서 생기는 물리적, 화학적인 스트레스로 인한 실활 이라고 볼 수 있는데 이를 개선하기 위해 앞으로 freezing programming2] 조절이나 건조 시 수분의 양의 최적화등 실험조건들을 보완한다면 이를 극복할 수 있을 것이다.

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