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제안 방법
- 37℃ incubator에서 배양시켰다. 2주 후 3개의 dish에 생성된 colony< 현미경을 사용하여 counting 한 수를 계산 후 평균을 계산하였다.
- 이렇게 4주를 배양하여 CFU-GM에서와같이 35ml gridded dish에 Methocult F4436 media를 1ml와 함께 균일하게 섞어 2주일간 5% CO2, 37℃ incubator■에서 배양시켰다. 2주후 3개의 dish에 생성된 colony를 현미경을 사용하여 counting 한 수를 계산 후 평균을 계산하 였다.
- 02g/L의 sodium bicarbonate와 pcnicilin - streptomycin(각각 10, 000 units/ml, 10, 000 〃 g/n기) 507/ g/ml, growth factor는 IL-3 5】】g/ml 와 stem cell factor(SCF) lOng/ml, Flt-3 ligand 25ng/ml을 넣고, FBS 10%와 IIS 10%를 넣어서 만들었다. spinner flask에서 골수 세포를 배양을 시작하고 이틀 후에는 media 30%에 준하는 growth factor를 첨가 해 주었고 그 이후로는 이틀마다 30%의 media를 교체해 주었다.
- stroma feeder layer를 위한 3T3 c이1을 한양대 의괴 대학 생화학 교실의 이상훈 교수님으로부터 분주 받아 배양하여 96w이]의 3곳에 2xi(/cells/ml의 농도로 0.1ml씩 넣어서 3T3 cell이 well 바닥 표면에 confluent 할 때 한양대 의과대학 치료방사선과에서 15cGy irradiation을 시킴으로써 성장을 멈추게 한 후 배양 0, 6, 10, 14일 때 spinner flask에 배양중인 bone matTOW를 2X lO’cells/ml의 농도로 stroma feeder layer가 첨가된 well 3곳에 첨가한다. °] well으】 media는 5% FBS IMDM를 사용하였고, 2틀에 한 번씩 half media change를 실시하였다.
- 1ml씩 넣어서 3T3 cell이 well 바닥 표면에 confluent 할 때 한양대 의과대학 치료방사선과에서 15cGy irradiation을 시킴으로써 성장을 멈추게 한 후 배양 0, 6, 10, 14일 때 spinner flask에 배양중인 bone matTOW를 2X lO’cells/ml의 농도로 stroma feeder layer가 첨가된 well 3곳에 첨가한다. °] well으】 media는 5% FBS IMDM를 사용하였고, 2틀에 한 번씩 half media change를 실시하였다. 이렇게 4주를 배양하여 CFU-GM에서와같이 35ml gridded dish에 Methocult F4436 media를 1ml와 함께 균일하게 섞어 2주일간 5% CO2, 37℃ incubator■에서 배양시켰다.
- 배양 0, 6, 10, 1시일 때 spinner flask에 배양 중인 bone marrow를 IxlOecells을 sampling 하여 서울 중앙 병원 생물공학 김미정 교수님의 도움으로 측정하였다.
- 있다. 본 실험에서는 IL-3와 SCFCstem cell factor), Flt-3 ligand# 이용하여 줄기세포의 배양을 해 보았다.
대상 데이터
- C57BL/6 Crsic 6주령 mouse 다섯 마리에서 골수를 채취하여 NHQ tris-buffer를 직접 제조하여 RPC를 제거 후 mononuclear c이】들을 분리해 내어 growth factor가 침가 되지 않은 5% FBS의 IMDM을 이용하여 washing 처리 후 50mI spinner flask에 15ml의 working vol니me으로 배양을 시작하였다.
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