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문제 정의
- 한 번의 실험으로 수천 개 이상의 결과를 얻게되는 마이크로어레이 데이 터는 각 실험결과를 하나의 집합으로 고려할 수 있으므로 엔트로피를 적용할 수 있다. 본 논문에서는 이 엔트로피 척도를 기반으로 한 전체 RNA 와 증폭 RNA를 비교하는 방법을 제안하고자 하며, 이를 통하여 전체 RNA와 증폭 RNA가 얼마나 유사한지에 대한 체계적인 분석을 시행하였다.
제안 방법
- 그림 3. 1개의 동일 암조직을 이용하여 전체 RNA, 1회 및 2회 증폭한 RNA를 사용한 마이크로어레이 이미지 비교.
- : 2㎍의 전체 RNA에 T7-oligo(dT) primer와 Superscript II를 첨가하여 역전사 반응시킴으로서 double strand cDNA를 합성하였다. 생성된 double strand cDNA 에 T7 MEGAscriptTM kit (Ambion, Inc.
- : 4㎍의 증폭된 mRNA에 random primer와 Superscript Ⅱ를 를 첨가하여 역전사시킴으로서 single strand cDNA를 합성하고, test samplee Cy3-dUTP로, reference samplee Cy5-dUTP로 labeling 하였다. 각각 Cy3-dUTP와 Cy5-dUTP로 labeling 된 cDNA> 정제하고 혼합한 후, 17,000개의 유전자가 점적되어 있는 마이크로어레이(GT-CMRC, 연세의대)을 사용하여 hybridization하였다.
- : 세포주와 정상 및 암 조직에 대하여 전체 RNA와 증폭 RNA간의 상관계수를 측정하였고, 평균값을 표 3과 같이 얻었다.
- : 얻어진 마이크로어 레 이 데 이 터 는 Within-pin Lowess algorithm[8]을 이용하여 표준화한 후, 계층적 군집분석 (Eisen software, Stanford Univ.)[3] 을 통해 전체적인 유전자의 발현양상을 관찰하였다. 데이터는 세포주와 정상 및 암 조직에 대하여 각각 전체 RNA 샘플과 여러가지 증폭 조건에 따른 증폭 RNA 샘플들이 있다.
- : 전체 RNA와 증폭 RNA간의 전반적인 발현 양상을 그림 3의 마이 크로어레 이 비 교와 그림 4의 계층적 군집 분석을 통하여 비교하였다.
- 각각 Cy3-dUTP와 Cy5-dUTP로 labeling 된 cDNA> 정제하고 혼합한 후, 17,000개의 유전자가 점적되어 있는 마이크로어레이(GT-CMRC, 연세의대)을 사용하여 hybridization하였다. Hybridization0] 끝난 마이크로어레이는 washing하여 GenePix 4000B scanner(Axon, Inc.
- 합성하였다. 생성된 double strand cDNA 에 T7 MEGAscriptTM kit (Ambion, Inc.)로 in vitro transcription을 수행하여 증폭된 mRNA를 합성하였다. 증폭된 mRNA의 양과 질은 Gene spec I spectrophotometer와 Bioanalyzer를 이용하여 확인하였다.
- 상관계수를 측정하는 경우 두 샘플의 발현 값만 알고 있으면 수식에 대입하여 구할 수 있지만, 엔트로피를 구할 경우에는 변화의 유무를 가릴 수 있는 임계값이 필요하다. 아직까지 어떤 값이 임계값으로 가장 적당하다고 알려진 바가 없기 때문에, 본 논문에서는 임계값 4를 1.5, 2, 3, 4로 변화시켜가며 측정하였다. 임계값 &의 의미는 특정 유전자에서 전체 RNA와 증폭 RNA간의 cy5/cy3 비율의 변화가 A:보다 작으면 그 유전자는 변화가 없는 그룹에 속한다는 것이고 k 이상일 때에는 변화가 큰 그룹에 속한다는 것이다.
- 전산학적인 실험으로는 기존 방법인 상관계수를 비교하는 것과 새롭게 제시한 엔트로피를 측정한 방법을 사용하였다. 상관계수를 측정하는 경우 두 샘플의 발현 값만 알고 있으면 수식에 대입하여 구할 수 있지만, 엔트로피를 구할 경우에는 변화의 유무를 가릴 수 있는 임계값이 필요하다.
- 조직과 세포주로부터 Trizol을 이용하여 전체 RNA를 추출한 후, 4개의 세포주는 동량으로 섞었다. 전체 RNA 의 양과 질은 Gene spec I spectrophotometer(Hitachi, inc.)와 Bioanalyzer(Agilent, Inc.)를 이용하여 확인하였다.
- )로 in vitro transcription을 수행하여 증폭된 mRNA를 합성하였다. 증폭된 mRNA의 양과 질은 Gene spec I spectrophotometer와 Bioanalyzer를 이용하여 확인하였다.
대상 데이터
- -80℃에 보관하였다. 4개의 종양 세포주(AGS, HL-60, HT29, HT1080)는 37℃, 5%, C02하에서 MEM 배지를 첨가하여 배양하였다. 조직과 세포주로부터 Trizol을 이용하여 전체 RNA를 추출한 후, 4개의 세포주는 동량으로 섞었다.
- 각 실험의 이름은 세포주의 경우 c, aC4, aC2, aCl, 2aC이고, 정상 조직의 경우는 N, aN4, aN2, aNl, 2aN, 암 조직의 경우는 T, aT4, aT2, aTl, 2aT이며, 각 기호의 의미는 표 1과 같다.
- 데이터는 세포주와 정상 및 암 조직에 대하여 각각 전체 RNA 샘플과 여러가지 증폭 조건에 따른 증폭 RNA 샘플들이 있다. 총 샘플의 수는 세포주가 다섯 개이며 정상 및 암 조직의 경우는 다섯 개의 쌍으로 총 10개였다.
성능/효과
- 관찰하였다. 또한 엔트로피는 전체 RNA와 증폭 RNA가 유사할 때뿐만 아니라 전체적으로 cy5/cy3 비율이 높게 증가하거나 감소한 경우에도 0에 가까운 값을 나타내기 때문에 유용한 척도임을 확인하였다.
- 52배 이하인 유전자의 비율이 80%로 나왔는데, 이는 앞의 결과와 마찬가지로 세포주에서 전체 RNA와 증폭 RNA간의 차이가 적다는 것을 의미한다. 비율을 높게 잡을수록 세포주와 조직에서 사용될 수 있는 임계값의 차이가 벌어지는 모습을 관찰할 수 있었는데, 이는 증폭에 따라 cy5/cy3 비율의 값이 크게 변하는 유전자의 수가 세포주보다 조직에서 많다는 것을 의미한다.
- 세포주에서는 비율의 차이가 1.37배 이하인 유전자의 비율이 80%이고, 정상 및 암조직에서는 비율 차이가 1.52배 이하인 유전자의 비율이 80%로 나왔는데, 이는 앞의 결과와 마찬가지로 세포주에서 전체 RNA와 증폭 RNA간의 차이가 적다는 것을 의미한다. 비율을 높게 잡을수록 세포주와 조직에서 사용될 수 있는 임계값의 차이가 벌어지는 모습을 관찰할 수 있었는데, 이는 증폭에 따라 cy5/cy3 비율의 값이 크게 변하는 유전자의 수가 세포주보다 조직에서 많다는 것을 의미한다.
- 전체 RNA와 증폭 RNA의 연관관계를 마이크로어레이 실험의 결과를 토대로 엔트로피 척도를 사용하여 분석하였고, 그 결과 기존의 분석방법과는 다른 방법으로 유사성을 관찰하였다. 또한 엔트로피는 전체 RNA와 증폭 RNA가 유사할 때뿐만 아니라 전체적으로 cy5/cy3 비율이 높게 증가하거나 감소한 경우에도 0에 가까운 값을 나타내기 때문에 유용한 척도임을 확인하였다.
- 전체적으로 엔트로피 값은 세포주에서 작고 조직에서 커서 세포주에서의 전체 RNA와 증폭 RNA가 유사하게 판별된 반면, 상관계수는 반대의 결과가 관찰되었다. 일단 세포주와 조직에서 서로 다른 값들이 나온 것은, 세포주와 조직을 연구할 때 다른 기준을 적용시키는 것이 필요하다는 것을 유추할 수 있다.
- 전체적으로 정상 조직과 암 조직은 비슷한 결과를 보여주었고, 세포주에서는 조직에서보다 낮은 엔트로피 값을 보여주었다. 이는 세포주에서 조직보다 전체 RNA와 증폭 RNA사이의 변화가 작다는 것을 의미한다.
- 보여주었다. 전체적으로 조직에서 세포주보다 높은 상관관계를 보여주었으며, 세포주에서 각 상관계수의 변화 정도가 가장 컸다.
- 같다. 즉, 전체 유전자에서 전체 RNA 와 증폭 RNA간의 발현 비율의 변화가 큰 유전자의 비율을 p로 놓으면 이 값이 0에 가까울 경우 엔트로피 값은 낮아지고, 이는 증폭 전후에 유전자들의 패턴 변화가 거의 없다는 것을 의미한다. 그리고 대부분 유전자의 발현비율이 크게 변한 경우에도 엔트로피 값은 0에 가까워지는데, 이는 전체적인 발현패턴 변화가 유사하다는 것을 의미한다.
- 표에서 알 수 있듯이 k가 1.5일 때는 세포주에서 증폭에 사용된 전체 RNA의 양에 따른 엔트로피 값의 변화가 컸다. 그러나 k가 2 이상일 때는 변화가 많이 감소하였다.
- 피어슨 상관계수와 코사인 계수의 경우 소수 둘째자리는 같은 값이 나왔으며, 발현값 대신 순위 벡터를 사용하는 스피어맨 상관관수의 경우 가장 낮은 값을 보여주었다. 전체적으로 조직에서 세포주보다 높은 상관관계를 보여주었으며, 세포주에서 각 상관계수의 변화 정도가 가장 컸다.
후속연구
- k값을 결정하고 엔트로피를 마이크로어레이의 분석에 이용함에 있어 생물학적 검증과 이에 근거한 두 군 간의 함수 관계에 대한 추후 연구가 필요하다.
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