[논문]FEP 멤브레인을 이용한 용존 산소 측정용 Clark-type 센서 제작

박정일; 장종현; 최명기; 이동영; 김영미; 박정호

문제 정의

본 논문에서는 세포의 산소호흡량을 측정하기 위한 Clark-type 센서제작에 기존 PP 멤브레인보다 산소투과율이 2배 이상 높은 FEP 멤브레인을 사용하여 그 특성을 평가하였다. 제안한 Clark-type 센서는 반도체 공정을 이용하여 쉽게 제작할 수 있다.
투과하는 멤브레인으로 구분된 구조이다. 샘플용액 내의 산소는 멤브레인을 투과하여 내부 전해질로 이동하고 작업 전극에서 환원되는데, 이때 발생한 용존산소의 환원 전류를 측정하여 그 농도를 분석하는 것이다. 작업 전극 및 상대 전극에서 일어나는 용존산소의 반응은 다음과 같다 [5].

제안 방법

다음으로 전극선절연 및 100um 두께의 내부 전해질 챔버를 구성하기 위해 SU-8 2100 photoresist를 스핀코팅한 후 패터닝하였다. 기준 전극 Ag/AgCl을 형성하기 하기 위해 potentiostat(PC₄/750, Gamry Instruments)을 이용하였고 0.1M KCl/Tris-HCl 용액 내에서 정전류 30nA을 10시간 동안 인가하여 chlorination함으로써 Ag 표면에 AgCl이 형성되도록 하였다[7]. 산소를 선택적으로 투과시키는 멤브레인으로 FEP(Fluorinated Ethylene Propylene, Strathkelvin Instruments)을 사용하였고 이를 작업 전 극 위에 형성된 마이크로 채널 위에 두어 PDMS reservoir와 연결되도록 하였다.
기준 전극 Ag/AgCl의 내구성 평가를 위해 0.1M KCl 용액에서 상용 Ag/AgCl 전극(RE-5B, Bioanalytical Systems Inc.)과 제작한 기준전극 사이에서의 OCP(Open Circuit Potential)를 측정하였다 [7]. 그림 4 는 상용 Ag/AgCl 전극과 제작한 기준 전극 사이의 OCP 측정 결과로, 2시간 동안 약 68mV로 안정한 결과를 보인다.
사용하였다 [6]. 기준 전극으로 사용될 박막형 Ag/AgCl 전극을 제작하고 그 내구성을 평가하였고, 이를 이용하여 Clark-type 센서를 설계하고 제작하였다. 제작한 Clark-type 센서는 산소 유무에 따른 CV(Cyclic Voltammetry) 그래프와 센서의 반응 시간, 산소 농도에 따른 전류 값 변화를 측정하고 이를 평가/분석하였다.
먼저 유리기판에 작업 전극 및 상대 전극으로 사용하기 위해 Ti/Au를, 기준 전극으로 사용될 부분에는 Ti/Ag를 500A/2500A 두께로 증착한 후 패터닝하였다. 다음으로 전극선절연 및 100um 두께의 내부 전해질 챔버를 구성하기 위해 SU-8 2100 photoresist를 스핀코팅한 후 패터닝하였다. 기준 전극 Ag/AgCl을 형성하기 하기 위해 potentiostat(PC₄/750, Gamry Instruments)을 이용하였고 0.
작업 전극과 상대 전극은 Au를, 기준 전극은 Ag/AgCl 전극을 사용하였다. 두 번째 층은 내부 전해질 챔버 구성 및 전극선 절연을 위한 것으로 SU-8 2100(MicroChem Corp.) photoresist로패 터닝하였다. 이때 두 영역으로 구분된 내부 전해질 챔버간 전해질 이동이 가능하도록 마이크로 채널을 형성하였다.
먼저 유리기판(Pyrex glass 7740 wafer)을 piranha 용액(H₂SO₄ : H₂O₂ = 4 : 1)에서 5분간 세척하였다. 먼저 유리기판에 작업 전극 및 상대 전극으로 사용하기 위해 Ti/Au를, 기준 전극으로 사용될 부분에는 Ti/Ag를 500A/2500A 두께로 증착한 후 패터닝하였다. 다음으로 전극선절연 및 100um 두께의 내부 전해질 챔버를 구성하기 위해 SU-8 2100 photoresist를 스핀코팅한 후 패터닝하였다.
1M KCl/Tris-HCl 용액 내에서 정전류 30nA을 10시간 동안 인가하여 chlorination함으로써 Ag 표면에 AgCl이 형성되도록 하였다[7]. 산소를 선택적으로 투과시키는 멤브레인으로 FEP(Fluorinated Ethylene Propylene, Strathkelvin Instruments)을 사용하였고 이를 작업 전 극 위에 형성된 마이크로 채널 위에 두어 PDMS reservoir와 연결되도록 하였다. 생체적합한 PDMS reservoir는 base PDMS와 curing agent를 10 : 1의 질량비로 혼합한 후 Teflon으로 제작한 몰드에 부어, 751 오븐에서 25분간 굳혀 제작하였다.
생체적합한 PDMS reservoir는 base PDMS와 curing agent를 10 : 1의 질량비로 혼합한 후 Teflon으로 제작한 몰드에 부어, 751 오븐에서 25분간 굳혀 제작하였다. 실리콘 접착제(3145 Silicone adhesive, Dow Corning)를 이용하여 이를 전극이 패터닝 된 기판과 접합하였다. 그림 3(b)는 제작된 Clark-type 센서를 보여준다.
내부 전해질 챔버는 두꺼운 photoresist인 SU-8 2100을 이용하여 구성하였고, 세포를 담을 수 있는 reservoir는 생체 적합한 PDMS을 사용하였다. 안정적인 전위를 측정하기 위해 Ag/AgCl 기준 전극을 제작하고 Clark-type 센서에 집적화하여그 특성을 평가하였다. 그 결과, 산소 유무에 따른 환원 전류의 차이가 50배에 이르고, 센서의 반응 시간도 40초로 민감하게 나타났으며 또한우수한 선형성을 나타내었다.
제작된 Clark-type 센서 내부 챔버에 내부 전해질 0.1M KCl을 채우고 reservoir에는 100ul의 측정용액을 담아 CV로 산소가 포화 되었을때 full-oxygen state; air-filled reservoir)와 산소가 없을 때 (zero-oxygen state; 0.1M Na/SOs)의 측정 결과를 비교하였다. 50mV/s 의 속도로 0 ~ -1.
기준 전극으로 사용될 박막형 Ag/AgCl 전극을 제작하고 그 내구성을 평가하였고, 이를 이용하여 Clark-type 센서를 설계하고 제작하였다. 제작한 Clark-type 센서는 산소 유무에 따른 CV(Cyclic Voltammetry) 그래프와 센서의 반응 시간, 산소 농도에 따른 전류 값 변화를 측정하고 이를 평가/분석하였다.

대상 데이터

제안한 Clark-type 센서는 반도체 공정을 이용하여 쉽게 제작할 수 있다. 내부 전해질 챔버는 두꺼운 photoresist인 SU-8 2100을 이용하여 구성하였고, 세포를 담을 수 있는 reservoir는 생체 적합한 PDMS을 사용하였다. 안정적인 전위를 측정하기 위해 Ag/AgCl 기준 전극을 제작하고 Clark-type 센서에 집적화하여그 특성을 평가하였다.
본 연구에서는 기존 연구에서 사용하였던 PP(polypropylene)보다 산소투과율이 2배 이상 높은 FEP(Fluorinated Ethylene Propylene)을 멤브레인으로 사용하였다 [6]. 기준 전극으로 사용될 박막형 Ag/AgCl 전극을 제작하고 그 내구성을 평가하였고, 이를 이용하여 Clark-type 센서를 설계하고 제작하였다.
첫 번째 층은 전압인가 및 측정을 위한 작업 전극, 상대 전극, 기준 전극으로 구성된다. 작업 전극과 상대 전극은 Au를, 기준 전극은 Ag/AgCl 전극을 사용하였다. 두 번째 층은 내부 전해질 챔버 구성 및 전극선 절연을 위한 것으로 SU-8 2100(MicroChem Corp.

성능/효과

PP 멤브레인을 사용하여 제작한 Clark-type 센서의 90% 반응 시간은 약 150초이고, FEP 멤브레인을 이용한 센서의 반응 시간은 약 40초로 관찰되었다. FEP을 사용한 센서의 90% 반응 시간이 PP의 경우 보다 3.
0V 범위에서 측정하였다. 그 결과, 그림 5과 같이 -0.8V에서 산소가 포화되었을 때의 전류값은 124nA이고 산소가 없을때는 2.5nA로, 미량의 측정용액에서 산소유무에 따른 환원 전류의 차이가 약 50배로 나타나 용존 산소 측정센서로 사용할 수 있음을 확인하였다.
안정적인 전위를 측정하기 위해 Ag/AgCl 기준 전극을 제작하고 Clark-type 센서에 집적화하여그 특성을 평가하였다. 그 결과, 산소 유무에 따른 환원 전류의 차이가 50배에 이르고, 센서의 반응 시간도 40초로 민감하게 나타났으며 또한우수한 선형성을 나타내었다. 앞으로 안정도, 재현성, life-tme 등 여러가지 특성 분석이 추가된다면 Clark-type 센서는 단일 세포 혹은 아주적은 양의 세포배양액에서 세포의 활성도를 측정할 수 있는 바이오센서로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

후속연구

그 결과, 산소 유무에 따른 환원 전류의 차이가 50배에 이르고, 센서의 반응 시간도 40초로 민감하게 나타났으며 또한우수한 선형성을 나타내었다. 앞으로 안정도, 재현성, life-tme 등 여러가지 특성 분석이 추가된다면 Clark-type 센서는 단일 세포 혹은 아주적은 양의 세포배양액에서 세포의 활성도를 측정할 수 있는 바이오센서로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

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