[논문]주성분 분석 방법을 이용한 유방암의 임상적 특징과 관련된 유전자 분석

Han, Mi-Ryung; Lee, Seok-Ho; Han, Won-Shik; Kim, Mi-Hyeon; Noh, Dong-Young; Kim, Ju-Han

문제 정의

본 논문에서는 cDNA microarray 기술을 이용하여 대량의 유전자 발현 프로파일을 얻었다. DNA에 있는 유전자 정보들을 분석해 내기 위한 cDNA microarray 기술은 현대 생명과학에서 점점 더 중요해지고있으며 한 번에 수만 혹은 수 십 만개의 유전자 발현 프로파일을 얻을 수 있다는 장점을 가지고 있다.
주성분 분석은 본래의 변수들의 변이 (variation)를 적은 수의 변환된 변수로 설명하는 것을 그 목적으로 한다. 이러한 변환된 변수는 본래의 변수들의 선형결합 중에서 분산이 큰 몇 개로 택하게 된다.
주성분 분석은 복잡한 genetic dataset으로부터 독립적인 주성분을 얻고 이것을 이용하여 molecular phenotypic profiles of clinical features를 분석하는 데에 이용되었다[2, 5], 즉 유방암의 지표가 되는 age, tumor size, tumor stage, lymph node metastasis, estrogen receptor status, c_erbB2 status, 재발여부와 같은 임상적 특징들을 주성분과의 상관관계를 이용하여 설명할 수 있는 것이다. 본 연구에서는 독립적인 주성분에 영향을 미치는 gene loading value중에 서 extreme loading value 값을 가지는 유전자를 유방암의 재발에 관련된 예후 인자로 정의하였다.
본 연구에서는 첫 번째 주성분에서 재발과 유의한 상관관계를 보인 ER (-) 환자 데이터를 이용하여 재발관련 진단 유전자를 찾았다. 첫 번째 주성분은 ER (-) 환자이면서 재발을 일으킨 경우와(b) 재발을 일으키지 않은 경우(a)에 molecular phenotype0] 서로 다르다는 것을 보여준다(그림 1).
본 연구에서는 cDNA microarray 기술을 이용하여 얻은 대량의 유전자 발현 프로파일을 분석하기 위하여 주성분 분석을 이용하였다. ER (-) 환자 데이터 분석에서 추출한 주성분과 임상정보 데이터와의 상관관계는 재발에 영향을 미치는 유전자를 찾는 데에기 여 한다.
ER (-) 환자 데이터 분석에서 추출한 주성분과 임상정보 데이터와의 상관관계는 재발에 영향을 미치는 유전자를 찾는 데에기 여 한다. 특히 ER (-) 환자는 adjuvant hormonal therapy로 치료되기가 어려우므로 ER (-)이면서 재발과 관련된 유전자는 예후 인자로써 의미가 있다.

제안 방법

이러한 변환된 변수는 본래의 변수들의 선형결합 중에서 분산이 큰 몇 개로 택하게 된다. 여기서는 유방암 환자로부터 얻은 유전자 발현 프로파일을 이 방법을 이용하여 분석하였다. 주성분 분석은 복잡한 genetic dataset으로부터 독립적인 주성분을 얻고 이것을 이용하여 molecular phenotypic profiles of clinical features를 분석하는 데에 이용되었다[2, 5], 즉 유방암의 지표가 되는 age, tumor size, tumor stage, lymph node metastasis, estrogen receptor status, c_erbB2 status, 재발여부와 같은 임상적 특징들을 주성분과의 상관관계를 이용하여 설명할 수 있는 것이다.
본 논문에서는 먼저 한국인 유방암 환자 73 명 의 molecular phenotypic profiles of clinical Matures를 주성분 분석을 이용하여 얻어진 주성분과의 상관관계로 분석하였다. 그리 고동 일한 방법으로 ER status에 따라 두 , 그룹으로 나누어(ER(+), ER(-)) 분석하였다.
그리 고동 일한 방법으로 ER status에 따라 두 , 그룹으로 나누어(ER(+), ER(-)) 분석하였다.
적어도 40% 이상 암세포를 가진 specimen만 실험에 사용되었고, 전체 RNA 는 TRIzoI solution (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 주출하였다. 전체 RNA 의 농도는 GeneSpec I spectrophotometer(Hitachi, Yokohama, Japan)를 이용하여 측정하였고, amplified tumor RNA는 Cy5 로, amplified Universal Human Reference RNA(Stratagene, La Jolla, CA) 는 Cy3 로 labeling하였다. Labeling한 amplified RNA는 43, 200개의 human cDNA clone 을 가지는 cDNA microarray slide에 hybridization하였다 [9].
각각의 cDNA microarray slide 는 Axon scanner 로 scanning 한 후, GenePix Pro3.0 (Axon Instruments, Foster City CA)을 사용하여 이미지 분석하였다. 이미지 분석 도중에, spot quality가 낮은 것은 직 접 눈으로 보면서 제거 하였다.
Missing value를 가지는 유전자는 분석에서 제외하였고, 43200개의 유전자 중에서 23806개의 유전자를'분석에 이용하였다. Bioconductor R package 를 이용하여 VSN transformation 을 한 뒤 , LOWESS normalization 을 하여 각 slide의 평균은 0, 표준편차는 1 이 되도록 하였다.
먼저 73명의 환자 데이터를 가지고 Bioconductor R package 로 주성분 분석을 하여 70개의 독립적인 주성분을 추출하였다. 각 주성분은 전체변동에 대한 상대적인 기여도에 따라 그 값이 내림차순으로 순위가 매겨진다.
총 51명의 환자는 36개월을 기준으로 재발을 일으키지 않은 환자 26명과 재발을 일으킨 환자 25명으로 구분된다. 이 때에는 주성분 분석을 사용하여 ER (+) 그룹으로부터 19개의 독립적인 주성분을, ER (-) 그룹으로부터 29개의 독립적인 주성분을 각각 추출하였다.
동일한 방법으로 19명의 환자와 29명의 환자에 대하여 각각 permutation test를 한 뒤, 두 그룹에서 얻은 F-value가 각각 유의한 것인지를 검증하였다.
다음으로 ER status (ER (+), ER (-))와 재발 여부와의 상관관계를 알아보았다. 20명의 ER (+) 환자와 31명의 ER (-) 환자 데이터에서 각각 추출한 19개, 29개의 주성분이 분석에 이용되었다.
이 중에서도 재발과 관련이 깊은 extreme positive loading value를 가지는 몇 가지 유전자를 찾아보았다(표 3). GeneBank accession 번호가 AA233079인 insulin-like growth factor binding protein l(IGFBP-l)은 유방암 환자의 재발과 관련된 중요한 유전자로 알려져 있다[13].
먼저 73명의 유방암 환자 데이터 전체를 분석하였을 때 ER status와 재발여부가 각각의 주성분과 유의한 상관관계를 보였고, 다음으로 두 그룹(ER (+), ER (-))에서 각각 재발 여부와의 상관관계를 분석하였다. ER (-) 환자 데이터로 주성분 분석을 하였을 때 가장 데이터를 잘 설명할 수 있는 첫 번째 주성분이 재발여부와 가장 유의한 상관관계를 보였으므로(F < .

대상 데이터

1996년 4월부터 2002년 9월까지 서울대학교병원에서 유방암 수술을 받은 73명의 한국인 primary invasive 유방암 환자를 대상으로 하였다. 유방암 수술 후 대부분의 환자는 chemotherapy (77.
냉동 보관하였다. 적어도 40% 이상 암세포를 가진 specimen만 실험에 사용되었고, 전체 RNA 는 TRIzoI solution (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 주출하였다. 전체 RNA 의 농도는 GeneSpec I spectrophotometer(Hitachi, Yokohama, Japan)를 이용하여 측정하였고, amplified tumor RNA는 Cy5 로, amplified Universal Human Reference RNA(Stratagene, La Jolla, CA) 는 Cy3 로 labeling하였다.
이미지 분석 도중에, spot quality가 낮은 것은 직 접 눈으로 보면서 제거 하였다. Missing value를 가지는 유전자는 분석에서 제외하였고, 43200개의 유전자 중에서 23806개의 유전자를'분석에 이용하였다. Bioconductor R package 를 이용하여 VSN transformation 을 한 뒤 , LOWESS normalization 을 하여 각 slide의 평균은 0, 표준편차는 1 이 되도록 하였다.
총 51명의 환자는 36개월을 기준으로 재발을 일으키지 않은 환자 26명과 재발을 일으킨 환자 25명으로 구분된다. 이 때에는 주성분 분석을 사용하여 ER (+) 그룹으로부터 19개의 독립적인 주성분을, ER (-) 그룹으로부터 29개의 독립적인 주성분을 각각 추출하였다.
20명의 ER (+) 환자와 31명의 ER (-) 환자 데이터에서 각각 추출한 19개, 29개의 주성분이 분석에 이용되었다. ER (+) 환자에서는 16번째 주성분이 재발여부와 가장 유의한 상관관계를 보이 고CP = 0.

데이터처리

주성분을 주줄할 때에는 표준편차가 현저히 작은 것은 제외하였다. 다음으로 주성분의 상대적인 기여 도와 임상 정보 데이터와의 상관관계를 보기 위해 one-way ANOVA가 사용되었다. R package를 사용하여 각각의 주성분과 다음에 해당하는 임상 정보 데이터와의 상관관계가 F-value로 계산되었다; age, tumor size, tumor stage, lymph node metastasis, estrogen receptor status, c_erbB2 status, 재 발여 부.
주 성분과 임상정보 데이터와의 one-way ANOVA test후에 ' 얻어진 Rvalue가 유의한 것인지를 검증하기 위해 R package 를이용하여 permutation test를 하였다[6]. 우선 각 환자에 번호를 매기고 번호를 임의로 섞은 후, 다시 임상정보 데이터와 one-way ANOVA test를 하여 Rvalue를 얻는다.
우선 각 환자에 번호를 매기고 번호를 임의로 섞은 후, 다시 임상정보 데이터와 one-way ANOVA test를 하여 Rvalue를 얻는다. 이때 서로 다른 70개의 F-value중에서 가장 높은 P-value 1개가 기록된다.
본 논문에서는 임상적 특징들을 유전자 발현 프로파일과의 상관관계로 설명하기 위해 주성분 분석을 이용하였다. 주성분 분석은 대량의 데이터를 분석할 때 차원을 줄이는 방법으로 쓰이고 있다.

성능/효과

2에 기술되어 있다. 2번째 주성분이 ER status와 가장 유의한 상관관계가 있고 (P < .00001, one-way ANOVA), 17번째 주성 분이 재발여부와 가장 유의한 상관관계가 있음을 알 수 있었다(F = 0.0008, one-way ANOVA). 이는 ER statue와 재발에 관련된 임상 정보 데이터가 본 연구에 사용된 유방암 환자 데이터와 유의한 연관성이 있음을 보여준다.
0008, one-way ANOVA). 이는 ER statue와 재발에 관련된 임상 정보 데이터가 본 연구에 사용된 유방암 환자 데이터와 유의한 연관성이 있음을 보여준다. 통계적인 유의성 검증(permutation test) 결과 나온 확률 값은 기존의 R value의 유의성이 유지됨을 증명하였다(ER;P = 0.
이는 ER statue와 재발에 관련된 임상 정보 데이터가 본 연구에 사용된 유방암 환자 데이터와 유의한 연관성이 있음을 보여준다. 통계적인 유의성 검증(permutation test) 결과 나온 확률 값은 기존의 R value의 유의성이 유지됨을 증명하였다(ER;P = 0.001, 재 발여 부; P = 0.004).
20명의 ER (+) 환자와 31명의 ER (-) 환자 데이터에서 각각 추출한 19개, 29개의 주성분이 분석에 이용되었다. ER (+) 환자에서는 16번째 주성분이 재발여부와 가장 유의한 상관관계를 보이 고CP = 0.072, one-way ANOVA), ER (-) 환자에서는 첫 번째 주성분이 재발 여부와 가장 유의한 상관관계를 보였다(F < .00001, one-way ANOVA). ER(-) 환자 데이터로 통계적 인 유의 성 검 증(permutation test)을 하여 얻은 확률 값은 기존의 F-value의 유의성이 유지됨을 증명하였다(재발여부; P = 0.
00001, one-way ANOVA). ER(-) 환자 데이터로 통계적 인 유의 성 검 증(permutation test)을 하여 얻은 확률 값은 기존의 F-value의 유의성이 유지됨을 증명하였다(재발여부; P = 0.001).
00001, one-way ANOVA) 본 연구에서 밝혀진 유전자는 예후 인자로써 의미가 있다. 이 때에 통계적인 유의성 검증(permutation test) 결과 나온 확률 값도 유의하게 나와 기존의 Rvalue가 유지됨을 증명하였다(재발 여부; P = 0.001). 첫 번째 주성분에 서 positive gene loading value 를 통해 밝혀진 유전자 중에서 특히 유방암의 재발, 형성과 관련이 깊은 유전자는 다음과 같다; Insulin-like growth factor binding protein 1, Tissue factor pathway inhibitor 2, Lymphocyte cytosolic protein 1 (L -plastin), Solute carrier family 39 (zinc transporter), Apolipoprotein A -I, LIM and SH₃ protein 1, GRB2 -associated binding protein 2, B lymphoid tyros ine kinase

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