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문제 정의
- 본 연구는 가축 증 송아지의 probiotics 미생물을 이용하기 위한 연구로서 사료 첨가용 생균제를 개발하기 위해 내담즙성과 내산성을 갖고 병원성세균을 저해하는 유산균을 분리 동정하는데 있다.
제안 방법
- MRS agar plate에 각 분리된 유산균을 증층한 후 항생제 paper disc를 사용하여 각 균주의 항생제 감수성을 비교 조사 하였다.
- 국내 축산농가에서 항생제를 사료에 사용하고 있으므로 각 분리된 균주에 대해 항생제 감수성에 대한 조사를 실시하였다(Table 2). 분리된 10균주 모두 colisthi과 ciprofhxacin에 대해 저항성을 모인 반면 ampicillin, amoxicliin 및 erythromycin에 대해서는 10균주 모두 감수성을 보여주었다.
- 8%로 가장 높은 생존율을 나타내었다. 내담즙성에서 선발돤 균주를 0.05M sodium phosphate(pH 2.5)인 인공위산에서 37℃로 2시간 진탕배양 후 생존율을 조사하였다.(Fig.
- 내담즙성을 분석하기위해 분리한 유산균 균주(108 cells/ml)을 MRS broth와 MRS broth+ 0.3% bile salt에 접종하여 37P 에서 8시간 배양한 다음 Spectrophotometer (Ultrospec 2000, Pharmacia Biotech, Sweden )을 이용하여 625nm에서 흡광도를 측정한 후 내담즙성을 나타내기 위한 생존율(%)을 계산하였다.
- 내산성을 분석하기위해 내담즙성 검사에서 선발된 분리균주(108 cell/ml)을 인공위산인 HC1 로 조정된 0.05M Sodium phosphate(pH2.5)에 접종한 후 37℃에서 2시간 진탕 배양한 다음 MRS agar plate에 도말한 후 한 후 48시간 배양 한 후 내산성을 나타내기 위한 생존율(%)을 계산 하였다.
-
2. 유산균 분리
분변을 0.1% peptone 수로 희석하여 MRS broth+0.5% bile salt와 MRS broth (PH4.5)에 접종하여 37 ℃ 에서 24시간 배양한 후 각각의 균주들을 MRS Agar+0.02% NaN3와 LAPT Agar에 도말한 후 37℃에서 48시간 배양한 다음 분리된 균주를 동정에 사용하였다.
- 선발된 10균주를 탄소원의 이용성차이로 동정하는 생화학적 방법언 API 50CHL kit로 동정하였다. 그 결과 10균주 모두 Lactobacillus sp에 속하는 유산균으로 동정되었고, 광학현미경상에서 모두 간균으로 관찰되었다(Table 3).
- 선발된 유산균은 Lactobacilli API 50 CHL kitCBioMerieux, France)를 사용하여 동정 하였다.
- 한우와 홀스타인 농가로부터 수집한 분변에서 무작위 선발법으로 MRS agar와 LAPT agar에서 자라는 간균형태의 54균주를 1차로 선발하였다. 담즙에 대한 내성을 조사하기 위해 1 차로 선발된 54 균주에 대해 (13% bile salt가 함유돤 MRS broth에서 배양 후 생존율을 조사한 결과(Fig.
대상 데이터
- 유산균 배양 배지로는 MRS broth와 Agar를 사용하였고 배양조건은 37℃에서 48시간 호기적으로 배양하였다. Salmonella typhimurium (KCTC 2514) 와 Staphylococcus aureus (KCTC 1928)는 TSA(Difco, U.S.A.) 배지를 사용하였고 배양조건은 37℃에서 24시간 배양하였다. Clostridium perfringens (ATCC 12917)는 RCA배지를 사용하여 Anaerobic jar 에 수소를 충진하여 35℃에서 혐기적으로 24시간 배양하였다.
- 분리하였다. 유산균 배양 배지로는 MRS broth와 Agar를 사용하였고 배양조건은 37℃에서 48시간 호기적으로 배양하였다. Salmonella typhimurium (KCTC 2514) 와 Staphylococcus aureus (KCTC 1928)는 TSA(Difco, U.
이론/모형
- aureus 및 Cl. perfringens 균이 중충된 agar plate상에 멸균된 Penicylinder(용량 300ul, ID 6mm, OD 8mm, H 10mm)를 일정간격으로 놓은 후 상등액을 200μl를 분주하여저해환의 크기를 비교하는 agar diffusion method를 사용하였다.
성능/효과
- 5)인 인공위산에서 37℃로 2시간 진탕배양 후 생존율을 조사하였다.(Fig. 2) 그 결과를 보면 LS15 균주가 82.6%로 가장 생존율이 높았고 그 다음으로 , LL6 균주는 80, 7%의 생존율을 보여주었다. 따라서 내담즙성과 내산성이 모두 우수한 균주는 LL6 균주임을 알 수 있었다.
- 그 결과 10균주 모두 Lactobacillus sp에 속하는 유산균으로 동정되었고, 광학현미경상에서 모두 간균으로 관찰되었다(Table 3). 3개의 병원성균에 대해 가장 우수한 항균력을 나타낸 LL6와 LL7 균주는 97.9% L. acidophMs로 동정되었고, 우수한 항균력을 나타낸 LS3 균주는 99*9% L. plantamm으로 동정되었다.
- thyphimurium에 대한 저해능력이 우수한 균주는 LL7과 LL6 균주로서 저해환의 크기는 각각 iLOmm와 10, 5mm로 나타났고, Sta. aureus에 대한 항균력 능력은 LL6 균주가 Umm로 가장 우수하며 그다음으로는 5개 균주 L12, LB1, LB2, LS3 및 LL7이 모두 10mm의 저해환을 보인 것으로 나타났다. 특히, 혐기성균인 Cl.
- 그 결과 10균주 모두 Lactobacillus sp에 속하는 유산균으로 동정되었고, 광학현미경상에서 모두 간균으로 관찰되었다(Table 3). 3개의 병원성균에 대해 가장 우수한 항균력을 나타낸 LL6와 LL7 균주는 97.
- 담즙에 내성이 있는 10균주는 0, 3% biie salt에서는 77, 6%-99, 8%의 생존율을 보였으며 특히, LL6와 LL7 균주의 경우 0.3% bile salt에서는 각각 99.2%와 99.8%로 가장 높은 생존율을 나타내었다. 내담즙성에서 선발돤 균주를 0.
- 6%로 가장 생존율이 높았고 그 다음으로 , LL6 균주는 80, 7%의 생존율을 보여주었다. 따라서 내담즙성과 내산성이 모두 우수한 균주는 LL6 균주임을 알 수 있었다. 선발된 10균주를 그람음성균인 Sal.
- 으로 동정되었다. 따라서 분리한 모든 균주는 생균제로서 사용이 가능한 안전성이 있는 유산균임을 확인 하였다. Fig.
- 대한 조사를 실시하였다(Table 2). 분리된 10균주 모두 colisthi과 ciprofhxacin에 대해 저항성을 모인 반면 ampicillin, amoxicliin 및 erythromycin에 대해서는 10균주 모두 감수성을 보여주었다.
- aureus에 대한 항균력 능력은 LL6 균주가 Umm로 가장 우수하며 그다음으로는 5개 균주 L12, LB1, LB2, LS3 및 LL7이 모두 10mm의 저해환을 보인 것으로 나타났다. 특히, 혐기성균인 Cl. perfnngens6^ 대한 항균력은 LL7 균주가 15mm로 가장 우수하였으며 그다음으로 LB1, LS3 및 LL6 균주가 14mm 의 저해환을 나타내었다. LS 15 균주는 병원성 균에 대해 모두 저해환을 나타내지 않았다.
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