[논문]PCR 방법에 의한 세균성 식중독균의 다중<tex> ${\\cdot}$</tex>동시 검출

박주연; 문선영; 이경하; 남정옥; 남보라; 김진만

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박주연 (건국대학교 축산대학 축산식품생물공학) , 문선영 (건국대학교 축산대학 축산식품생물공학) , 이경하 (건국대학교 축산대학 축산식품생물공학) , 남정옥 (건국대학교 축산대학 축산식품생물공학) , 남보라 (건국대학교 축산대학 축산식품생물공학) , 김진만 (건국대학교 축산대학 축산식품생물공학)

병원성미생물을 분리${\cdot}$동정하는 방법으로 선택배지를 이용하는 검사방법은 4${\sim}$7일의 시간이 소요되는 단점이 있으며, 기존의 PCR방법은 대부분 단일 병원성 미생물만을 검출할 수 있는 반면 본 연구에서 사용된 시스템은 6종류의 세균성 식중독균을 한 번의 분석으로 확인할 수 있었기 때문에 비용과 분석시간을 대폭 절감하는 효과가 있었다. Fig. 1은 6종류의 세균성 식중독균이 혼합된 시료에 각각의 단일 프라이머를 이용하여 특이성을 확인한 결과이며, Fig. 2는 멀티플렉스 프라이머를 이용하여 각각의 세균성 식중독균 열 추출 시료에 대한 특이성을 확인한 결과이다. PCR 산물들이 사다리(ladder) 형태로 증폭됨으로써 동시에 6종류의 세균성 식중독균을 용이하게 확인할 수 있었다(Lane 1${\sim}$Lane 6). 또한 3종류의 세균성 식중독균이 혼합된 열 추출시료에서도 특이적인 PCR 증폭 산물들을 탐지할 수 있었다(Lane 10 & Lane 11).

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문제 정의

, Shigella spp, , Listeria monocytogenes)을 PCRCPolymerase Chain Reaction) 방법을 이용하여 다중 . 동시 검출하는 방법을 개발하고자 기획되었다.

제안 방법

Korea)을 이용하였다(Table 1). 다중중합효소연쇄반응은 UDG활성을 위하여 50℃에서 3분간 처리하였으며, 그 후 초기 변성(initial denaturation)을 94℃에서 2분간 수행한 후, 변성 (denaturation, 94℃에서 30초), 결합(annealing, 60℃에서 30초), 연장(extension, 72℃에서 30초)을 총 40회 실시하고, 마지막으로 연장(extension, 72℃에서 5분)을 실시하였다.
그 후 배양액을 1ml# 취한 후 12000rpm에서 5분간 원심분리를 하여 상층액을 제거하고 모아진 균체를 멸균증류수 200nl 에 현탁한 후 100 ℃에서 5분간 가열처리하고 10,000rpm에서 10분간 원심분리한 후 상중액을 희수하여 이를 열 추출 시료로 사용하였다. 열 추출 시료는 PCR 반웅을 실시한 후 전기영동(2% agarose gei)으로 전개시켜 결과를 분석하였다.

대상 데이터

본 연구에 사용된 6종류의 세균성 식 중독균(E. co//O₁₅7:H₇, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus. Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Shigella spp.)을 Nutrient broth에 접종한 후 mcubator에서 24~36시간동안 배양하였다. 그 후 배양액을 1ml# 취한 후 12000rpm에서 5분간 원심분리를 하여 상층액을 제거하고 모아진 균체를 멸균증류수 200nl 에 현탁한 후 100 ℃에서 5분간 가열처리하고 10,000rpm에서 10분간 원심분리한 후 상중액을 희수하여 이를 열 추출 시료로 사용하였다.

이론/모형

co//O₁₅7:H₇, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Salmonella spp., Shigella spp, , Listeria monocytogenes)을 PCRCPolymerase Chain Reaction) 방법을 이용하여 다중 . 동시 검출하는 방법을 개발하고자 기획되었다.
PCR 반응을 위해서는 PowerCheck™ Multiplex Pathogen Detection System (Kogenebiotech, Seoul. Korea)을 이용하였다(Table 1). 다중중합효소연쇄반응은 UDG활성을 위하여 50℃에서 3분간 처리하였으며, 그 후 초기 변성(initial denaturation)을 94℃에서 2분간 수행한 후, 변성 (denaturation, 94℃에서 30초), 결합(annealing, 60℃에서 30초), 연장(extension, 72℃에서 30초)을 총 40회 실시하고, 마지막으로 연장(extension, 72℃에서 5분)을 실시하였다.

성능/효과

2는 멀티플렉스 프라이머를 이용하여 각각의 세균성 식중독균 열 추출시료에 대한 특이성을 확인한 결과이다. PCR 산물들이 사다리(ladder) 형태로 증폭됨으로써 동시에 6종류의 세균성 식중독균을 용이하게 확인할 수 있었다(Lane 1 eLane 6). 또한 3종류의 세균성 식중독균이 혼합된 열 추출시료에서도 특이적인 PCR 증폭 산물들을 탐지할 수 있었다 (Lane 10 & Lane ¹¹⁾.
1에 나타낸 순서와 같으며 각각의 세균성 식중독균에 특이적인 PCR산물이 증폭된 결과를 나타내고 있다. PCR 산물들이 사다리(ladder) 형태로 증폭됨으로써 동시에 6종류의 세균성 식중독균을 용이하게 확인할 수 있었다. 7번 레인은 Control DNA(Cl)을, 8번 레인은 Control DNA(C₂) 그리고 9번 레인은 Negative control의 증폭결과를 나타내고 있다.
반응이 끝난 PCR 산물을 2% agarose gel상에서 단일 프라이머 및 멀티플렉스 프라이머를 이용하여 전기영동한 후 균주 특이적 유전자증폭 산물의 형성유무 및 크기로, 특정 병원성 미생물의 존재를 확인할 수 있었다.
병원성미생물을 분리 - 동정하는 방법으로 선택배지를 이용하는 검사방법은 4~7일의 시간이 소요되는 단점이 있으며, 기존의 PCR방법은 대부분 단일 병원성 미생물만을 검출할 수 있는 반면 본 연구에서 사용된 시스템은 6종류의 세균성 식중독균을 한 번의 분석으로 확인할 수 있었기 때문에 비용과 분석시간을 대폭 절감하는 효과가 있었다.

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