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제안 방법
- PCR을 이용한 가공식품의 GMO 검출. GM 콩의 함량 별 두부와 비지 시료에서 GM 콩을 검출하기 위해 PCR 산물의 크기가 큰 600 bp를 증폭할 수 있는 CMV, EPSPS primer set 과 PCR 산물의 크기가 작은 123 bp를 증폭할 수 있는 EPSPS5', EPSPS3' primer set를 각각 이용하였고, 콩의 내재유전자인 ferritin을 기초로 하여 제작된 242 bp의 산물의 크기를 갖는 primer set을 하나의 tube에 넣어 duplex-PCR-g- 수행하였다. 이때 600 bp의 epsps product가 생성되는 실험에서 두부의 경우 Fig.
- Lateral Flow Strip Test lateral flow strip test(LFST)을 이용하여 콩가공식품인 두부와 비지로부터 재조합단백질을 검출하기 위해 각각 5 g의 콩원료, 두부, 비지의 시료들을 튜브에 넣고 제작사가 제시하는 방법에 따라 Trait RUR Bulk Soybean lest Kit와 Trait RUR Ibasted Meal Test Kit(Strategic Diagnostics Inc., USA)을 이용하여 5분간 반응시켜 결과를 확인하였다.
- 5 mM each, TaKaRa, Japan) 그리고 50 ng의 template DNA가 포함되도록 하였고, 반응은 thermocycler PTC100-60HB(MJ Research, USA)를 이용하여 수행하였다. PCR 조건으로 첫 cycle에서 95℃에서 3분간 수행하였고 나머지 cycle에서는 95℃에서 30초, 60P에서 30초, 72℃에서 1분간 40 cycles을 수행하였으며, 마지막 단계로 72℃ 에서 8분간 수행한 후, 41에서 PCR산물을 보존하였다. PCR 산물은 3% agarose gel상에서 전기영동을 수행하였다.
- 이러한 현상은 콩의 가공과정 중에 열에 의해 큰 분자량의 DNA가 작은 크기로 파괴된 것으로 생각된다. PCR을 이용한 가공식품의 GMO 검출. GM 콩의 함량 별 두부와 비지 시료에서 GM 콩을 검출하기 위해 PCR 산물의 크기가 큰 600 bp를 증폭할 수 있는 CMV, EPSPS primer set 과 PCR 산물의 크기가 작은 123 bp를 증폭할 수 있는 EPSPS5', EPSPS3' primer set를 각각 이용하였고, 콩의 내재유전자인 ferritin을 기초로 하여 제작된 242 bp의 산물의 크기를 갖는 primer set을 하나의 tube에 넣어 duplex-PCR-g- 수행하였다.
- 두부는 두유에 염화마그네슘을 첨가하여 저은 후 5분간 방치하여 응고시킨 시료액을 사각 틀에 넣고 뚜껑으로 눌러 두부를 만들어 시료로 사용하였다. 각각의 시료는 두 개씩 제조하였고, 냉동건조기를 이용하여 시료를 건조한 후, 사용하였다.
- 일차항체인 EPSPS 다중항체는 1000 :1로 희석하여 2시간 동안 반응시킨 후, . 같은 방법으로 washing을 한 후 이차항체 인 Antimouse IgG(Sigma, USA)를 10000: IS 희석하여 1시간 처리하였고, 위와 동일한 방법으로 washing을 수행하였다. 최종적으로 western blotting 검출은 ECL(Amersham Bioscience, USA)를사용하여 확인하였다.
- 면역학적 방법을 이용한 가공식품의 GMO 검출. 두부와 비지로부터 추출한 단백질들을 SDS-PAGE로 전기영동을 한 결과 Fig.
- PCR 반응 용액은 시료 당 25 uZ로 만들어 사용하였다. 반응 용액은 1.5mM MgC&를 포함하는 10XPCR buffer(TaKaRa, Japan) 2.5 u/, 10nM의 sense primer, 10 nM의 antisense primer, 2 ul dNTP(2.5 mM each, TaKaRa, Japan) 그리고 50 ng의 template DNA가 포함되도록 하였고, 반응은 thermocycler PTC100-60HB(MJ Research, USA)를 이용하여 수행하였다. PCR 조건으로 첫 cycle에서 95℃에서 3분간 수행하였고 나머지 cycle에서는 95℃에서 30초, 60P에서 30초, 72℃에서 1분간 40 cycles을 수행하였으며, 마지막 단계로 72℃ 에서 8분간 수행한 후, 41에서 PCR산물을 보존하였다.
- 본 연구에서는 GM콩을 원료로 한 두부, 비지 등 가공식품에 대하여 우리나라 GMO 표시제의 기준치인 3% 시료들을 준비하여 PCR 방법과 면역학적 분석방법을 사용하여 검출의 민감도를 측정하여 가공식품에 대한 검정방법들을 비교하였다.
- 사용하였다. 분쇄된 콩 분말을 GM과 non-GM을 각각 무게비율로 혼합한 후 시료로 사용하였다.
- 1g에 lysis buffer(2 M thiourea, 7M urea, 4%(w/v) CHAPS) 900uZ와 l%(w/v) DDT 100 uZ를 섞어 3시간 동안 shaking한 후에 12, 000Xg에서 30분간 원심분리하여 상층액을 취하였다. 상층액과 같은 양의 2 X sample bufFer(25 ml 4xTris-Cl, 20ml glycerol[20%(w/v)], 4g SDS[4%(w/v)], 2ml 2-ME, 1 mg bromphenol blue[0.001% (w/v)])와 섞어 95℃에서 5분간 처리한 후 Bradford법으로 단백질을 정량하였으며, 12% SDS-PAGE상에서 추출 패턴을 확인하였다.
- DNA 추출. 제조된 두부와 비지 시료들은 동결 건조하여 -70℃ 에서 보관한 후, 실험에서 각각의 분말형태의 시료를 0.1g씩 DNeasy Plant Mini kit(Qiagen, US A)을 이용하여 DNA를 추출하였다. 주줄된 DNA는 UV-spectrophotometer(Hitachi, Japan)를 이용하여 260nm에서 정량하였다.
- 주줄된 DNA는 UV-spectrophotometer(Hitachi, Japan)를 이용하여 260nm에서 정량하였다. 추출된 DNA는 0.8%의 agarose gel상에서 50 volt로 30분 동안 전기영동 하여 상태를 확인하였으며, marker로는 100 bp ladder(Bioneer, Korea)와 X- HindUKNew England BioLabs Inc., USA)을 사용하였다.
- Western blotting. 추출된 단백질들은 12% SDS-PAGE 방법을 사용하여 100 volt에서 2시간 전기영동한 후, Mini transblot cell kit(Bio-Rad, USA)을 이용하여, gel 상의 단백질을 4℃에서 25 volt로 16시간 동안 nitro cellulose membrane(Schleicher & Schuell, Germany)으로 이동시켰다. Membranee 6% non-fat milk로 blocking 시킨 후에 10분씩 3회 washing을 수행하였다.
대상 데이터
- 1과 같다. GMO에 삽입된 glyphosate(N-phosphonomethyl glycine)에 강한 저항성을 갖는 Agrobacterium tumefaciens CP4 의 5- enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase(epsps) 유전자11-12)를 근거로 primer를 제작하였으며 내재 유전자로는 콩에 존재하는 ferritin 유전자13)를 활용하였다. 이들 각각에 대한 유전자 배열은 Table 1에 나타내었다.
- 7/을 넣고 20분간 가열하였다. 거즈로 거른 후 걸러진 비지와 거즈를 통과한 두유를 채취하여 시료로 사용하였다. 두부는 두유에 염화마그네슘을 첨가하여 저은 후 5분간 방치하여 응고시킨 시료액을 사각 틀에 넣고 뚜껑으로 눌러 두부를 만들어 시료로 사용하였다.
- 가공식품제조. 본 실험의 경우 정확한 혼입비율을 만들기 위하여 분쇄된 콩 분말을 만들어 사용하였다. 콩 분말 100 g에 증류수 1.
- 재료 Non-GM콩은 농어촌 유통공사에서 수입된 미국산 콩을 정량분석하여 GMO가 함유되지 않은 것을 확인한 후, non- GM 콩으로 이용하였으며, GM 콩은 미국 SDI 사로부터 Glyphosate 저항성 콩 (Roundup Ready Soybean)을 공급 받아 분쇄하여 사용하였다. 분쇄된 콩 분말을 GM과 non-GM을 각각 무게비율로 혼합한 후 시료로 사용하였다.
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