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문제 정의
- 따라서 본 연구는 녹용 mitochondria genome에 존재하는 D-loop 유전자의 변이를 이용하여 녹용의 유전자 감별법에 대한 적용 가능성을 제시하고자 수행하였다.
제안 방법
- PCR cycle은 최초 94°C에서 3분간 예비 가열 후 94°C에서 45초, 54°C에서 45초 그리고 72°C에서 70초를 1회로 하여 총 35회 반복한 후 최종적으로 72°C에서 3분간 last extension을 수행하였다.
- PCR 종료 후, mtDNA D-loop영역의 475bp증폭 산물의 제한효소 처리는 PCR product를 PCR purification kit(Qiagen, 독일)로 추출 한 다음, 6ul의 증폭산물을 HhaI와 Taal 두가지 제한 효소를 이용하여 HhaI은 37°C에 Taal은 65°C에서 각각 2시간 이상 반응하여 절단했다.
- PCR 증폭산물을 agarose gel로 전기 영동 하여 확인 한 후 PCR purification kit로 추출한 ABI Prism™ terminater Cycle Sequencing kit(Perkin-Elmer Cetus, USA)를 사용하여 제작회사의 protocol 준하여 DNA sequencer(ABI 3730)를 이용한 Capillary 방식의 형광 염기서열 분석을 수행하였다.
- PCR 종료 후, mtDNA D-loop영역의 475bp증폭 산물의 제한효소 처리는 PCR product를 PCR purification kit(Qiagen, 독일)로 추출 한 다음, 6ul의 증폭산물을 HhaI와 Taal 두가지 제한 효소를 이용하여 HhaI은 37°C에 Taal은 65°C에서 각각 2시간 이상 반응하여 절단했다. 각 제한 효소로 절단하여 얻어진 DNA단편을 확인하기 위해 2% agarose gel로 전기영동 하여 분리 한 후 ethidium bromide 용액으로 염색하여 Gel Document System을 통해서 DNA band를 확인하였다.
- 녹용을 유전자의 변이로서 수입 국가 혹은 서식 지역을 판별할 수 있는지를 평가하기 위해서 녹용의 mtDNA의 D-loop영역에서 한 쌍의 primer를 제작하여 475bp의 PCR 증폭산물을 얻어 DNA 염기서열을 결정하였다. 결정된 DNA 염기서열을 sequence alignment program인 Lasergene을 통해서 러시아산 붉은 사슴에서 결정된 D-loop 영역의 염기서열과 다른 종에서 결정된 D-loop 영역의 염기서열의 변이를 비교 분석한 결과, 러시아산 붉은 사슴에서 결정된 D-loop 영역은 기존에 보고된 염기서열과 일치 하였으며 본 연구를 통해서 러시아산 붉은 사슴의 D-loop는 두 가지 RFLP 좌위가 있는 것으로 나타났다.
- 녹용의 mtDNA의 D-loop 영역 가운데 475bp 단편을 증폭하기 위한 primer로서 forward primer는 5‘GGTTGCTGGTTTCACGCGGCA그리고 reverse primer는 5’ATTTAAACTATTCCCTGACGC의 염기배열을 설계하여 Bionee사r(한국)로부터 합성하였으며, PCR 증폭은 Takara사의 PCR thermal cycler Dice를 이용하여 다음과 같은 조건하에서 실시하였다.
- 또한, GeneBank에 등록된 엘크(alces alces), 순록(Rangifer tarandus)의 염기서열을 기초로 하여 두 가지 형태의 러시아산 붉은 사슴의 D-loop 유전자와의 염기서열을 분석하였다. 결과적으로 엘크 사슴의 D-loop 유전자의 153번째 DNA의 염기가 A임을 확인하였으며 이 부위는 HhaI 제한효소 인식부의 결실 부위로서 러시아산 붉은 사슴과는 구별되지는 않지만, 제한효소 Taal의 인식부위가 100bp로 나타나 붉은 사슴의 174bp와는 상이한 RFLP 패턴을 보여 러시아산 붉은 사슴과 엘크도 mtDNA의 D-loop 유전자의 RFLP 패턴으로 판별이 가능할 것으로 생각된다.
- PCR 증폭산물을 agarose gel로 전기 영동 하여 확인 한 후 PCR purification kit로 추출한 ABI Prism™ terminater Cycle Sequencing kit(Perkin-Elmer Cetus, USA)를 사용하여 제작회사의 protocol 준하여 DNA sequencer(ABI 3730)를 이용한 Capillary 방식의 형광 염기서열 분석을 수행하였다. 염기서열은 Lasergene program(DNA STAR, Inc.,Madison, WI, USA)과 GenBank의 BLAST search를 이용하였다. 염기의 계통학적 관계를 밝히기 위하여 이미 알려진 방법에 따라 Lasergene의 Mega Align module을 이용하였다[11]
- 먼저 러시아산 붉은 사슴에서 결정된 D-loop 영역의 153번째 DNA의 염기가 A로, 다른 종에서 결정된 D-loop 영역의 염기서열이 G인 것과 달랐다. 이 부위는 제한효소 HhaI의 인식부위(GCGC)이므로 확인된 DNA 염기변이의 유전자형을 결정하기 위해 HhaI에 의한 PCR-RFLP 방법을 수행하였다(그림. 1). 그림 1에서 보는 바와 같이 HhaI 제한 효소(GCGC)로 절단하였을 때 인식부위의 변이에 따라 비교한 다른 종들은 310bp와 174bp, 224bp와 174bp의 각각 2개의 단편으로 분리 되었고, 러시아산 붉은 사슴은 G 단일 염기의 결실로 인하여 HhaI이 제한효소 인식부위를 절단할 수 없어 475bp의 단일 band 만이 확인되었다.
- 녹용의 mtDNA의 D-loop 영역 가운데 475bp 단편을 증폭하기 위한 primer로서 forward primer는 5‘GGTTGCTGGTTTCACGCGGCA그리고 reverse primer는 5’ATTTAAACTATTCCCTGACGC의 염기배열을 설계하여 Bionee사r(한국)로부터 합성하였으며, PCR 증폭은 Takara사의 PCR thermal cycler Dice를 이용하여 다음과 같은 조건하에서 실시하였다. 즉 반응액은 0.5 ml tube에 template DNA 약 100ng, primer 각 0.5uM dNTP 각 200uM, 10xPCR buffer 그리고 Taq DNA polymerase 2 unit를 첨가하여 최종 PCR 반응액을 총 20ul로 조정하였다. PCR cycle은 최초 94°C에서 3분간 예비 가열 후 94°C에서 45초, 54°C에서 45초 그리고 72°C에서 70초를 1회로 하여 총 35회 반복한 후 최종적으로 72°C에서 3분간 last extension을 수행하였다.
대상 데이터
- 본 연구에 사용된 재료는 (주)주성제약에서 제공한 63개의 sample에서 사슴뿔의 일부를 채취하였다.
이론/모형
- 시료로부터 genomic DNA의 분리 및 정제는 proteinase K-lysis방법을 이용한 genomic isolation kit(Qiagen, 독일)를 사용하였고 분리된 DNA는 TE buffer(10mM Tris-Hcl, pH 8.5)에 용해하였다.
- ,Madison, WI, USA)과 GenBank의 BLAST search를 이용하였다. 염기의 계통학적 관계를 밝히기 위하여 이미 알려진 방법에 따라 Lasergene의 Mega Align module을 이용하였다[11]
성능/효과
- 또한, GeneBank에 등록된 엘크(alces alces), 순록(Rangifer tarandus)의 염기서열을 기초로 하여 두 가지 형태의 러시아산 붉은 사슴의 D-loop 유전자와의 염기서열을 분석하였다. 결과적으로 엘크 사슴의 D-loop 유전자의 153번째 DNA의 염기가 A임을 확인하였으며 이 부위는 HhaI 제한효소 인식부의 결실 부위로서 러시아산 붉은 사슴과는 구별되지는 않지만, 제한효소 Taal의 인식부위가 100bp로 나타나 붉은 사슴의 174bp와는 상이한 RFLP 패턴을 보여 러시아산 붉은 사슴과 엘크도 mtDNA의 D-loop 유전자의 RFLP 패턴으로 판별이 가능할 것으로 생각된다.
- 녹용을 유전자의 변이로서 수입 국가 혹은 서식 지역을 판별할 수 있는지를 평가하기 위해서 녹용의 mtDNA의 D-loop영역에서 한 쌍의 primer를 제작하여 475bp의 PCR 증폭산물을 얻어 DNA 염기서열을 결정하였다. 결정된 DNA 염기서열을 sequence alignment program인 Lasergene을 통해서 러시아산 붉은 사슴에서 결정된 D-loop 영역의 염기서열과 다른 종에서 결정된 D-loop 영역의 염기서열의 변이를 비교 분석한 결과, 러시아산 붉은 사슴에서 결정된 D-loop 영역은 기존에 보고된 염기서열과 일치 하였으며 본 연구를 통해서 러시아산 붉은 사슴의 D-loop는 두 가지 RFLP 좌위가 있는 것으로 나타났다. 먼저 러시아산 붉은 사슴에서 결정된 D-loop 영역의 153번째 DNA의 염기가 A로, 다른 종에서 결정된 D-loop 영역의 염기서열이 G인 것과 달랐다.
- 1). 그림 1에서 보는 바와 같이 HhaI 제한 효소(GCGC)로 절단하였을 때 인식부위의 변이에 따라 비교한 다른 종들은 310bp와 174bp, 224bp와 174bp의 각각 2개의 단편으로 분리 되었고, 러시아산 붉은 사슴은 G 단일 염기의 결실로 인하여 HhaI이 제한효소 인식부위를 절단할 수 없어 475bp의 단일 band 만이 확인되었다.
- 러시아산 붉은 사슴의 D-loop 영역 두 번째 RFLP 좌위는 200번째에 위치한 C로서 비교한 다른 종에서 결정된 D-loop 영역의 염기서열이 T인 것과 달랐다. 이 부위는 제한효소 Taal의 인식부위로 품종별 RFLP 양상은 Fig.2에서 처럼 Taal 제한효소(ACNGT)로 절단하였을 때 인식부위의 절단 양상에 따라 러시아산 붉은 사슴(A type)를 포함하여 다른 종들은 각각 255bp와 220bp, 276bp와 122bp, 126bp와 129bp 등 각각 2개의 단편으로 분리되었고, 러시아산 붉은 사슴(B type)은 T 단일 염기의 결실로 인하여 제한 효소 인지부위가 소실되어 475bp의 단일 band만이 검출됨이 확인되었다.
후속연구
- 따라서 중국, 호주, 뉴질랜드 등의 국가에서 수입되는 녹용이 국내에서 유통될 때에 러시아 산 붉은 사슴으로 둔갑 유통, 판매되는 경우가 종종 발생되어 사회 문제가 되고 있다. 또한, 만성소모성 질병(CWD)이 북미에서 발병하면서 C. elaphus canadasis, Alces alces, 및 녹용으로 사용되지 않는 Rangifer tarandus이 중국 등 제3국을 통해 일부가 우리나라로 수입되는 경우가 보고된다는 점을 고려해 보면 mtDNA의 D-loop 유전자의 RFLP 패턴 비교 분석은 러시아산 붉은 사슴의 녹용과 엘크, 순록의 뿔 그리고 여러 일반 녹용의 판별에 매우 유용하게 이용될 수 있을 뿐만 아니라 녹용의 품질 인증 및 부정 유통의 근절에 적용이 가능 할 것으로 기대된다.
- 이와 같은 결과로 볼 때 녹용에서 추출한 mtDNA의 D-loop 유전자를 두 가지의 제한효소, HhaI과 Taal 제한 효소의 절단 패턴의 조합을 이용하면 A와 B 두 가지 형태의 유전자형을 갖는 러시아산 붉은 사슴의 판별이 가능할 것으로 생각되며 이와 같은 유전자형에 대한 RFLP 패턴을 통해서 고가의 러시아산 붉은 사슴 (a,b)의 녹용과 다른 일반 녹용을 감별하는데 유용한 DNA marker로서 이용 할 수 있을 것으로 기대된다.
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