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문제 정의
- 본 과제에서는 빈산소에 의한 발생학적인 단계에서의 배 발생률 및 gonad 세포에서의 HSP70의 유전자 와 glutathione reductase발현양상을 확인함 으로써 산소가 고갈된 빈산소 해역이 얼마나 많은 생태계를 위협하는지 확인해 보았다.
- 빈 산소에 노출 될 경우 가장 빈번한 유전자의 발현량 차이를 보일 것으로 예상되어지는 HSP70 유전자와 항산화 효소인 glutathione reductase 발현 차이를 확인해 보았다. HSP70의 경우 빈산소를 처리하였을 때 0 시간과 비교하여 12시간째에 약 5.
제안 방법
- 산란기에 있는 성게 수컷에 1 N KCl 용액으로 자극을 주어 정자를 추출했다. 성게를 수조에서 꺼낸 후 입을 위로하고 입 주위의 막을 주사기로 찔러 KCl 용액을 주입하고 기다려 항문 주위 생식공에서 나오는 우유빛의 정자를 파스퇴르 피펫으로 조심스럽게 뽑아 사용했다. 정자의 추출과 마찬가지로 성게 암컷에 1 N KCl을 주입하고 해수가 담긴 비커에 거꾸로 올려놓고 생식공에서 방출하는 주황색 알을 모았다.
- 성게를 수조에서 꺼낸 후 입을 위로하고 입 주위의 막을 주사기로 찔러 KCl 용액을 주입하고 기다려 항문 주위 생식공에서 나오는 우유빛의 정자를 파스퇴르 피펫으로 조심스럽게 뽑아 사용했다. 정자의 추출과 마찬가지로 성게 암컷에 1 N KCl을 주입하고 해수가 담긴 비커에 거꾸로 올려놓고 생식공에서 방출하는 주황색 알을 모았다. 약 30분 동안 알을 모은 후 알 사이의 점액질 제거를 위해 알을 세척하여 사용하였다.
- 빈산소에 정자를 노출시킨 후 알을 주입하여 정자와 알이 만나 수정이 이루어지도록 20분정도 기다린 후 포르말린 용액을 주입하여 수정을 중단시킨 후 수정률을 측정했다. 수정률은 알의 바깥쪽에 수정막이 형성되어 있는지 여부를 관찰하여 수정란과 미수정란으로 구분하였다.
- 빈산소에 정자를 노출시킨 후 알을 주입하여 정자와 알이 만나 수정이 이루어지도록 20분정도 기다린 후 포르말린 용액을 주입하여 수정을 중단시킨 후 수정률을 측정했다. 수정률은 알의 바깥쪽에 수정막이 형성되어 있는지 여부를 관찰하여 수정란과 미수정란으로 구분하였다.
- 추출한 알에 정자 원액을 처리하여 체외 수정시킨 후 사용하였다. 약 10분 후 일부의 수정률을 측정하여 95% 이상의 알이 수정에 성공했을 때 빈 산소노출용 수정란으로 사용했으며 수정란은 200 cell/ml 정도의 적정밀도로 희석하였다. 수정이 시작되면 발생이 계속 진행되므로 빈 산소에 노출시켜 발생률을 측정했다.
- 약 10분 후 일부의 수정률을 측정하여 95% 이상의 알이 수정에 성공했을 때 빈 산소노출용 수정란으로 사용했으며 수정란은 200 cell/ml 정도의 적정밀도로 희석하였다. 수정이 시작되면 발생이 계속 진행되므로 빈 산소에 노출시켜 발생률을 측정했다. 발생률은 플루테우스 유생으로 발생이 진행된 정상유생과 비정상 유생으로 구분했으며 비정상 유생은 발생이 멈추거나 지연되어 포배기 혹은 낭배기까지 발생된 경우 등을 모두 포함하였다.
- 수정이 시작되면 발생이 계속 진행되므로 빈 산소에 노출시켜 발생률을 측정했다. 발생률은 플루테우스 유생으로 발생이 진행된 정상유생과 비정상 유생으로 구분했으며 비정상 유생은 발생이 멈추거나 지연되어 포배기 혹은 낭배기까지 발생된 경우 등을 모두 포함하였다.
- 산란기의 성게 성체를 빈 산소에 72시간 동안 노출시킨 후 성게 생식소 (gonad cell)를 채집 하였다. 성게의 생식소는 노출 후 성게 성체를 반으로 잘라 spatula를 사용해서 분리하였다.
- 성게의 생식소는 노출 후 성게 성체를 반으로 잘라 spatula를 사용해서 분리하였다. 분리 한 생식소는 protein extract solution (Intron)을 사용해서 단백질을 추출 하였다. 추출한 단백질은 nano drop를 사용해서 정량하였다.
- 이후 TBS로 다시 2회간 세척하고 primary antibody (heat shock protein 70)와 secondary antibody (mouse-IgG)에 1시간 동안 담가둔다. 3 M paper의 단백질은 형광물질 ECL solution을 사용하여 flim으로 확인 하였다.
- 용존산소농도 2 ppm 이하의 해수에 20분 동안 노출된 정자를 이용하여 난자에 첨가한 후 수정률을 비교하였다. 빈 산소를 처리하지 않은 즉 일반 해수를 처리한 그룹을 대조군으로 하여 5번 반복 실험하였으며 빈산소를 처리한 실험군 또한 5번 반복 실험을 통하여 결과를 확인하였다 (표 1.
- 용존산소농도 2 ppm 이하의 해수에 20분 동안 노출된 정자를 이용하여 난자에 첨가한 후 수정률을 비교하였다. 빈 산소를 처리하지 않은 즉 일반 해수를 처리한 그룹을 대조군으로 하여 5번 반복 실험하였으며 빈산소를 처리한 실험군 또한 5번 반복 실험을 통하여 결과를 확인하였다 (표 1.). 대조군의 경우 평균적으로 97.
- 추출한 알에 성게 정자를 이용하여 체외 수정을 실시하였으며 일반 해수에서 처리한 대조군과 빈 산소를 처리한 실험군으로 나누어 실험을 수행하였다. 각 100개 이상의 난자를 이용하여 실험을 수행하였으며 3반복을 수행하였다.
- 추출한 알에 성게 정자를 이용하여 체외 수정을 실시하였으며 일반 해수에서 처리한 대조군과 빈 산소를 처리한 실험군으로 나누어 실험을 수행하였다. 각 100개 이상의 난자를 이용하여 실험을 수행하였으며 3반복을 수행하였다. 수정 후 15 hr 경과 후 배발생 단계에서 blastula 단계에 도달한 그룹을 이용하여 각각의 발생량을 확인한 결과에서는 수정된 모든 개체에서 모두 발생하는 것을 확인 할 수 있었다.
대상 데이터
- 실험에 사용한 둥근성게 (Strongylocentrotus nudus) 성체는 산란기에 경남 거제 연안에서 직접 채집하여 한국해양연구원 남해연구소 양식동의 수조에서 다시마를 먹이로 하여 배양하였다.
- 산란기에 있는 성게 수컷에 1 N KCl 용액으로 자극을 주어 정자를 추출했다. 성게를 수조에서 꺼낸 후 입을 위로하고 입 주위의 막을 주사기로 찔러 KCl 용액을 주입하고 기다려 항문 주위 생식공에서 나오는 우유빛의 정자를 파스퇴르 피펫으로 조심스럽게 뽑아 사용했다.
성능/효과
- ). 대조군의 경우 평균적으로 97.85 %의 높은 수정률을 확인하였으며 실험군에서 또한 95.68 %의 비교적 높은 수정률을 확인할 수 있었다. 따라서 빈 산소에 의해 수정률의 변화는 크게 확인 할 수 없었다.
- 각 100개 이상의 난자를 이용하여 실험을 수행하였으며 3반복을 수행하였다. 수정 후 15 hr 경과 후 배발생 단계에서 blastula 단계에 도달한 그룹을 이용하여 각각의 발생량을 확인한 결과에서는 수정된 모든 개체에서 모두 발생하는 것을 확인 할 수 있었다. 하지만 수정 후 48 시간 경과 후 prism 단계에서의 배 발생률에서는 큰 차이를 확인 할 수 있었다.
- 하지만 수정 후 48 시간 경과 후 prism 단계에서의 배 발생률에서는 큰 차이를 확인 할 수 있었다. 대조군 3반복 모두에서 수정이 된 수정란의 경우는 모두 배 발생이 완료된 것을 확인 할 수 있었으며 상대적으로 빈 산소 처리 그룹에서는 모두 prism 상태로 발생이 되지 않는 것을 확인 할 수 있었다 (표 2). 현미경을 통한 관찰에서도 위와 같은 사실을 확인 할 수 있었다 (그림 1).
- 결론적으로 초기 배 발생 단계에서는 빈 산소에 의해 성게에서 거의 영향이 없는 것에 반해 후기 배 발생 단계에서는 극과 극의 영향력이 미치는 것을 확인 할 수 있었다.
- 빈 산소에 노출 될 경우 가장 빈번한 유전자의 발현량 차이를 보일 것으로 예상되어지는 HSP70 유전자와 항산화 효소인 glutathione reductase 발현 차이를 확인해 보았다. HSP70의 경우 빈산소를 처리하였을 때 0 시간과 비교하여 12시간째에 약 5.32배가 증가하는 현상을 확인 하였으며 24시간째에도 5.64배가 증가하는 현상을 western blot analysis와 상대적인 발현양 비교로 확인할 수 있었다. 일반적으로 HSP70의 경우 스트레스가 증가 할 시에 증가하는 단백질로 알려져 있으며 따라서 빈산소가 성게 수정란에 상당히 많은 스트레스를 주는 것으로 확인하였다.
- 일반적으로 HSP70의 경우 스트레스가 증가 할 시에 증가하는 단백질로 알려져 있으며 따라서 빈산소가 성게 수정란에 상당히 많은 스트레스를 주는 것으로 확인하였다. 또한 항산화 효소 중의 하나인 glutathione reductase의 경우도 빈산소의 경우 RT-PCR의 결과에서 약 2.79배 증가하는 현상을 상대적인 발현으로 확인하였다.
- 빈산소 환경에 의한 둥근성게에서의 배 발생률의 변화를 확인한 결과 발생이 유도 되지 않은 것을 확인하였으며 또한 스트레스 관련 유전자 또는 항산화 관련 유전자의 증가를 통해 빈산소가 둥근성게에 확실한 독성이 있음을 확인 할 수 있었다.
후속연구
- 빈 산소에 의한 생물 반응 연구는 대부분 연구 대상 생물이 포유류에 한정되어 있다. 성게에 대한 빈 산소 상태에서의 연구는 거의 이루어 져 있지 않으며 따라서 성게 배 발생에서부터 gonad 세포에 대한 연구 더 나아가 빈 산소에 의한 유전자발현 차이에 대한 연구는 충분히 가치가 있을 것으로 판단된다.
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