초록 ▼

본 발명은 플라스미드 pCMV-dhfr 및 이것을 이용하여 에리트로포이에틴(Erythropoietin;이하 EPO라고 약칭한다)을 제조하는 방법에 관한 것이다.본 발명은 특히 dhfr 유전자가 연결되어 있는 SV40 프로모터 128-270 부위를 제거하여 pRc/CMV에 삽입하여 발현벡타 pCMV-dhfr을 만들고 여기에 인간 EPO 유전자를 클로닝하여 pEpoG-dhfr 또는 pEpoC-dhfr을 만든후 이것으로 CHO 세포를 형질전환시켜 얻은 세포주 g2 또는 ECl으로부터 2nM 이하의 낮은 농도의 MTX 함유 α-MEM 배지

본 발명은 플라스미드 pCMV-dhfr 및 이것을 이용하여 에리트로포이에틴(Erythropoietin;이하 EPO라고 약칭한다)을 제조하는 방법에 관한 것이다.본 발명은 특히 dhfr 유전자가 연결되어 있는 SV40 프로모터 128-270 부위를 제거하여 pRc/CMV에 삽입하여 발현벡타 pCMV-dhfr을 만들고 여기에 인간 EPO 유전자를 클로닝하여 pEpoG-dhfr 또는 pEpoC-dhfr을 만든후 이것으로 CHO 세포를 형질전환시켜 얻은 세포주 g2 또는 ECl으로부터 2nM 이하의 낮은 농도의 MTX 함유 α-MEM 배지에서 고역가의 EPO를 경제적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.

대표청구항 ▼

SV40 프로모터 128-270 부위를 제거하여 만든 프로모터에 연결시킨 dhfr 유전자를 함유하며 CMV 프로모터에 다클로닝부위(multi cloning site)를 연결시킨 벡터 pCMV-dhfr(KCTC 8671P).제1항의 벡터 pCMV-dhfr에 유전자형 EPO 유전자를 삽입시켜 얻은 pEpoG-dhfr 플라스미드(KCTC 0181BP).제1항의 벡터 pCMV-dhfr에 cDNA형 EPO 유전자를 삽입시켜 얻은 pEpoC-dhfr 플라스미드(KCTC 0180BP).제2항 또는 제3항의 플라스미드로 안정하게 형질전환되어 인간

SV40 프로모터 128-270 부위를 제거하여 만든 프로모터에 연결시킨 dhfr 유전자를 함유하며 CMV 프로모터에 다클로닝부위(multi cloning site)를 연결시킨 벡터 pCMV-dhfr(KCTC 8671P).제1항의 벡터 pCMV-dhfr에 유전자형 EPO 유전자를 삽입시켜 얻은 pEpoG-dhfr 플라스미드(KCTC 0181BP).제1항의 벡터 pCMV-dhfr에 cDNA형 EPO 유전자를 삽입시켜 얻은 pEpoC-dhfr 플라스미드(KCTC 0180BP).제2항 또는 제3항의 플라스미드로 안정하게 형질전환되어 인간 에리트로포이에틴을 생성하는 능력을 갖는포유류 유래 진핵세포인 형질전환체.제4항에 있어서, pEpoC-dhfr 플라스미드로 형질전환된 것을 특징으로 하는 g2 형질전환체(KCTC 0183BP).제4항에 있어서, pEpoC-dhfr 플라스미드로 형질전환되 것을 특징으로 하는 ECl 형질전환체(KCTC 0182BP).제4항에 있어서, 진핵세포가 dhfr CHO 변이 세포주인 것을 특징으로 하는 형질전환체.제4항의 형질전환체를 배양하여 인간 에리트로포이에틴을 제조하는 방법.제8항에 있어서, 배양액이 MTX가 함유된 α-MEM 배지인 것을 특징으로 하는 인간 에리트포포이에틴을 제조하는 방법.제9항에 있어서, MTX 농도를 20nM 이하로 유지하는 조건으로 세포주 g2~20을 배양하는 것을 특징으로 하는 인간 에리트로포이에틴을 제조하는 방법.제10항에 있어서, 세포주로 g2~20은 MTX 농도에서 적응된 g2 형질전환체인 것을 특징으로 하는 인간 에리트로포이에틴을 제조하는 방법.제9항에 있어서, MTX 농도를 20nM 이하로 유지하는 조건으로 세포주 ECl~20을 배양하는 것을 특징으로 하는 인간 에리트로포이에틴을 제조하는 방법.제12항에 있어서, 세포주 ECl~20은 MTX 농도에서 적응된 ECl 형질전환체인 것을 특징으로 하는 인간 에리트로포이에틴을 제조하는 방법.※ 참고사항 : 최초출원 내용에 의하여 공개하는 것임.