초록

본 발명은 신속하고, 인공물이 없고, 향상된, 짧은 DNA "태그" 또는 그것의 배열들 얻는 방법을 제공하며, 이 방법은 주어진 mRNA 집단내에 유전자 전사의 상대적 어번던스를 측정할 수 있게 하고 그리고 새로운 유전자들을 확인하는 것 뿐만아니라 유전자 전사의 패턴을 식별하는 것에 유용하다.

대표청구항 ▼

하기의 단계를 포함하는 태그를 얻는 방법:(a) 이중-가닥 cDNA를 제공하는 단계,(b) 상기 이중-가닥 cDNA를 중단(punctuating) 제한 엔도뉴클레아제로 절단하여 cDNA 단편을 제공하는 단계,(c) 상기 cDNA 단편에, 타입 IIs 제한 엔도뉴클레제에 대한 인식 서열로부터 떨어져 있는 cDNA 단편의 하나의 부위에서 DNA 절단을 허용하는 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열을 포함하는 5' 어댑터를 연결하여 제1 cDNA 구조체를 제공하는 단계,(d) 상기 제1 cDNA 구조체를 상기 타입 IIs 제

하기의 단계를 포함하는 태그를 얻는 방법:(a) 이중-가닥 cDNA를 제공하는 단계,(b) 상기 이중-가닥 cDNA를 중단(punctuating) 제한 엔도뉴클레아제로 절단하여 cDNA 단편을 제공하는 단계,(c) 상기 cDNA 단편에, 타입 IIs 제한 엔도뉴클레제에 대한 인식 서열로부터 떨어져 있는 cDNA 단편의 하나의 부위에서 DNA 절단을 허용하는 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열을 포함하는 5' 어댑터를 연결하여 제1 cDNA 구조체를 제공하는 단계,(d) 상기 제1 cDNA 구조체를 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제로 절단하여 제2 cDNA 구조체를 제공하는 단계, (e) 상기 제2 cDNA 구조체에 3' 어댑터를 연결하여, 상기 제2 cDNA 구조체의 3'에 인접하여 위치된 중단 엔도뉴클레아제에 대한 제한서열을 생성함에 의해 제3 cDNA 구조체를 제공하는 단계, (f) 상기 제3 cDNA 구조체를 상기 중단 제한 엔도뉴클레아제로 소화하여 cDNA 서열들을 포함하는 태그를 제공하는 단계, 및 (g) 상기 태그의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계.제 1항에 있어서, 상기 중단 제한 엔도뉴클레아제는 MspI이고 그리고 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제는 BsgI인 것을 특징으로 하는 방법.제 1항에 있어서, 태그들을 연결하여 태그들의 배열을 제공하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.제 3항에 있어서, 상기 태그들의 배열을 벡터로 도입하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.하기와 같은 단계를 포함하는 태그의 배열을 얻는 방법:(a) 비오틴화된 올리고 dT 프라이머를 사용하여 mRNA로부터 이중가닥 cDNA를 제공하는 단계,(b) 상기 이중 가닥 cDNA 안을 중단 제한 엔도뉴클레아제로 절단하여 cDNA 단편의 집단을 제공하는 단계, (c) 상기 cDNA 단편을 하기와 같이 구성되는 5' 어댑터에 연결하여 제2 cDNA 구조체를 제공하는 단계: i) 상기 중단 제한 엔도뉴클레아제로 절단함에 의해 생성된 말단들과 회합성의 단일 가닥 말단; ii) 상기 단일 가닥 말단의 5'에 위치된 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열; 및 iii) 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열의 5'에 위치된 5'-클로닝 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식서열, (d) 상기 제1 cDNA 구조체를 고체상 스트렙타비딘 상에서 친화성 포획에 의해 분리하는 단계,(e) 상기 제1 cDNA 구조체를 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제로 절단하여 제2 cDNA 구조체를 제공하는 단계,(f) 상기 제2 cDNA 구조체를 하기와 같이 구성되는 3' 어댑터에 연결하여 제3 cDNA 구조체를 제공하는 단계: i) 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 의해 생성된 말단들과 회합성의 축퇴성 단일 가닥 말단; ii) 상기 축퇴성 말단의 3'에 위치된 상기 중단 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열; 및 iii) 상기 중단 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식서열의 3'에 위치된 3'-클로닝 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열, (g) 상기 제3 cDNA 구조체를 5' 및 3'-클로닝 제한 엔도뉴클레아제로 소화하여 제4 cDNA 구조체를 제공하는 단계, (h) 제4 cDNA 구조체를 상기 5' 및 3'-클로닝 제한 엔도뉴클레아제로 소화된 클로닝 벡터로 삽입하는 단계, (i) 상기 벡터 DNA를 적절한 숙주 균주에서 복제하는 단계, (j) 상기 벡터 DNA를 분리하는 단계, (k) 상기 벡터 DNA를 상기 중단 제한 엔도뉴클레아제로 소화하여 cDNA 서열을 포함하는 태그 및 GC 클램프를 제공하는 단계, 및(l) 상기 태그들을 적어도 10태그 및 GC 풍부 클램프들을 포함하는 태그들의 배열을 제공하도록 연결하는 단계. 제 5항에 있어서, 상기 중단 제한 엔도뉴클레아제는 Mspl이고 그리고 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제는 Bsgl인 것을 특징으로 하는 방법.제 5항에 있어서, 상기 5' 클로닝 제한 엔도뉴클레아제는 EcoR1이고 상기 3'-클로닝 제한 엔도뉴클레아제는 Notl인 것을 특징으로 하는 방법.유전자 전사 패턴을 식별하는 방법으로, 상기 방법은 관심의 출처원으로부터 유래된 제1항에 따른 하나 이상의 태그를 제공하고 그리고 유전자 전사의 패턴을 확인하는 것으로 이루어지는 방법.2 이상의 mRNA 집단들 사이에 유전자 전사에서 차이점을 검출하는 방법으로, 상기 방법은 하나 이상의 샘플에서 제8항에 따른 유전자 전사 패턴을 식별하고 그리고 제1 mRNA 집단으로부터 유전자 집단의 패턴들을 또 다른 샘플로부터의 유전자 전사의 패턴과 비교하는 것으로 이루어지는 방법. 하기의 단계들을 포함하는 mRNA 집단에서 유전자 전사의 상대적 빈도를 결정하는 방법:(a) 제5항에 따른 태그들의 배열을 제공하는 단계,(b) 태그들의 배열을 서열화하는 단계, 및(c) 태그의 상대적 빈도를 측정하는 단계. 하기의 단계들을 포함하는 세포상의 스트레스를 선별하는 방법:(a) 스트레스, 또는 관심의 생리학적 스트레스 없이 유전자 전사의 패턴을 확인하는 단계, (b) 관심의 스트레스 존재하에 유전자 전사의 패턴을 확인하는 단계, 및 (c) 제8항에 따라서 (a) 및 (b)로부터의 유전자 전사의 패턴을 비교하는 단계. 하기의 단계들을 포함하는 표적 유기체에서 스트레스 존재를 검출하는 방법:(a) 정상 세포 또는 조직에서 차별적으로 발현된 유전자의 태그 서열을 제공하는 단계, (b) 제1 세포 또는 조직으로부터 얻은 cDNA 라이브러리를 상기 태그와 혼성화시키는 단계, (c) 제2 세포 또는 조직으로부터 얻은 cDNA 라이브러리를 상기 태그 서열과 혼성화시키는 단계, 및(d) 상기 제1 및 제2 세포 또는 조직에서 상기 유전자의 전사 수준을 비교하는 단계. 유전자를 분리하는 방법으로, 상기 방법은 제1항에 따른 태그를 포함하는 프로브로 cDNA 라이브러리를 프로빙하고 그리고 유전자를 분리하는 것으로 이루어지는 방법.태그 또는 태그들의 배열을 얻기 위한 키트로, (a) 5' 어댑터, (b) 3' 어댑터,(c) 벡터, 및 (d) 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제.