초록

본 발명은 식물의 세포간극으로부터 단백질을 추출하는 방법에 관한 것으로서,상기 방법은 식물세포에 의해 합성된 많은 목적 활성 단백질들을 대규모로 분리하는데 사용할 수 있으며, 식물숙주로부터 재조합생성된 단백질을 추출하기 위해 상업용으로 사용되며, 실시가능한 재조합 단백질 생성을 위한 소스로서 식물을 대규모로 사용할 수 있게 하는 것을 특징으로 한다.

대표청구항 ▼

(a)완충액에 의해 식물 잎을 침윤시키는 단계;(b)식물조직과 완충액을 진공환경에 넣는 단계;(c)완충액으로부터 조직을 제거하는 단계;(d)조직을 원심분리하여 간질액을 제거하는 단계; 및(e)간질액으로부터 목적 단백질을 농축시키는 단계로 구성된, 식물조직의 간질액으로부터 목적하는 농축된 활성 단백질을 대규모로 추출하는 방법.제 1 항에 있어서,상기 조직은 바스켓 원심분리기에 의해 원심분리되는 것을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서,상기 단백질은 한외 여과법에 의해 농축되는 것을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서,상기 단백

(a)완충액에 의해 식물 잎을 침윤시키는 단계;(b)식물조직과 완충액을 진공환경에 넣는 단계;(c)완충액으로부터 조직을 제거하는 단계;(d)조직을 원심분리하여 간질액을 제거하는 단계; 및(e)간질액으로부터 목적 단백질을 농축시키는 단계로 구성된, 식물조직의 간질액으로부터 목적하는 농축된 활성 단백질을 대규모로 추출하는 방법.제 1 항에 있어서,상기 조직은 바스켓 원심분리기에 의해 원심분리되는 것을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서,상기 단백질은 한외 여과법에 의해 농축되는 것을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서,상기 단백질은 확장층 크로마토그래피에 의해 농축되는 것을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서,상기 식물조직은 잎, 줄기, 어린 가지, 꽃, 과실 및 뿌리로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서,완충액에 의해 식물 잎을 침윤시키기 전에, 주맥을 따라 식물 잎을 자르는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서,상기 완충액은 시트레이트, 인산염 및 트리스로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.제 7 항에 있어서,상기 완충액은 라우로콜산 나트륨, SDS, 트리톤, Tween(상표명)s, 인지질, 담즙산염, 소듐 디옥시콜레이트 및 소듐 라우릴 설페이트로 구성된 군에서 선택되는 제제를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.제 7 항에 있어서,상기 완충액은 EDTA, EGTA 및 시트레이트로 구성된 군에서 선택되는 킬레이터를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.제 7 항에 있어서,상기 완충액은 α-메르캅토 에탄올, 아스코르브산염, 소듐 메타비설페이트 및 디티오트레이톨로 구성된 군에서 선택되는 산화방지제를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서,상기 식물 잎 및 완충액은 200-760㎜Hg의 진공압력으로 가해지는 것을 특징으로 하는 방법.제 11 항에 있어서,상기 진공압력은 400-760㎜Hg인 것을 특징으로 하는 방법.제 11 항에 있어서,상기 진공압력은 740-760㎜Hg인 것을 특징으로 하는 방법.제 11 항에 있어서,상기 진공압력은 760㎜Hg인 것을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서,상기 원심분리는 50-5,000×G의 중력 범위에서 진행되는 것을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서,상기 원심분리는 약 2,000×G의 중력 범위에서 진행되는 것을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서,상기 목적 단백질은 재조합 식물 바이러스 벡터에 의해 식물내에서 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서,상기 목적 단백질은 유전자도입 식물에 의해 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서,상기 목적 단백질은 식물내에서 자연적으로 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서,원심분리하기 전에, 조직으로부터 과량의 완충액을 배출시키거나 또는 흡수하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서,불연속적인 일련의 방법에 의해 완충액으로부터의 조직을 원심분리기로 이동시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서,원심분리에 의해 간질액을 제거한 후에 남은 조직으로부터 목적 단백질을 정제하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서,상기 단백질은 원형질 관통막, 페록시좀, 관련 세포막, 기타 세포기관, 핵, 골지체, 세포기질, 조면 및 활면 소포체, 미토콘드리아, 액포 및 엽록체로 구성된 군에서 선택되는 세포성분으로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서,목적 단백질은 리보솜 불활성 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서,목적 단백질은 인간의 리소좀 효소인 것을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서,목적 단백질은 산업용 효소인 것을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서,목적 단백질은 시토킨인 것을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서,목적 단백질은 항체 또는 항체 단편인 것을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서,목적 단백질은 α-갈락토시다아제 또는 α-갈락토시다아제의 아이소자임인 것을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서,목적 단백질은 글루코세레브로시다아제 또는 글루코세레브로시다아제의 아이소자임인 것을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서,목적 단백질은 세포내 특정 구획으로 단백질을 안내하는 시그널 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서,한 종류 이상의 단백질이 동시에 정제될 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.(a)완충액에 의해 식물 조직을 침윤시키는 단계;(b)식물 조직과 완충액을 진공환경에 넣는 단계;(c)완충액으로부터 조직을 제거하는 단계;(d)조직을 원심분리하여 간질액을 제거하는 단계; 및(e)간질액으로부터 단백질을 농축시키는 단계로 구성된, 식물 조직의 간질액으로부터 추출된, 식물로부터 얻은 단백질.제 33 항에 있어서,목적 단백질은 α-갈락토시다아제 또는 α-갈락토시다아제의 아이소자임인 것을 특징으로 하는 단백질.제 33 항에 있어서,목적 단백질은 글루코세레브로시다아제 또는 글루코세레브로시다아제의 아이소자임인 것을 특징으로 하는 단백질.제 33 항에 있어서,목적 단백질은 리보솜 불활성 단백질인 것을 특징으로 하는 단백질.제 33 항에 있어서,목적 단백질은 인간의 리소좀 효소인 것을 특징으로 하는 단백질.제 33 항에 있어서,목적 단백질은 산업용 효소인 것을 특징으로 하는 단백질.제 33 항에 있어서,목적 단백질은 시토킨인 것을 특징으로 하는 단백질.제 33 항에 있어서,목적 단백질은 항체 또는 항체 단편인 것을 특징으로 하는 단백질.제 1 항에 있어서,상기 식물조직은 벌크 회전식 진공침윤 탱크에 의해 상기 식물조직에 완충액을 불연속적으로 운반함으로써 상기 완충액에 의해 침윤되는 것을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서,상기 침윤은 회전식 입구 및 회전식 배출 밸브를 구비한 내부 오거를 포함하는 원통형 압력용기에 의한 연속식 침윤인 것을 특징으로 하는 방법.제 2 항에 있어서,상기 바스켓 원심분리기는 약 2000-2500×G에서 간질액을 추출하기 위해, 저속으로 부하 또는 배출되고, 가속화될 수 있으며, 잎재료는 스플릿 로터 디자인을 통해 배출되는 것을 특징으로 하는 방법.(a)완충액에 의해 식물조직을 침윤시키는 단계;(b)식물조직과 완충액을 진공환경으로 넣는 단계;(c)완충액으로부터 조직을 제거하는 단계;(d)조직을 원심분리하여 간질액을 제거하는 단계; 및(e)간질액으로부터 생체 분자를 농축시키는 단계로 구성된, 지질, 탄수화물, 지단백질, 다당류, 당, 지방산, 핵산 및 폴리뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택된 목적하는 농축된 생체분자를 대규모로 추출하는 방법.제 44 항에 있어서,조직은 바스켓 원심분리기에 의해 원심분리되는 것을 특징으로 하는 방법.제 44 항에 있어서,상기 생체분자는 한외 여과법에 의해 농축되는 것을 특징으로 하는 방법.제 44 항에 있어서,상기 생체분자는 확장층 크로마토그래피에 의해 농축되는 것을 특징으로 하는 방법.제 44 항에 있어서,상기 식물조직은 잎, 줄기, 어린 가지, 꽃, 과실 및 뿌리로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.제 44 항에 있어서,완충액에 의해 식물 잎을 침윤시키기 전에, 식물 잎을 주맥을 따라 자르는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.제 44 항에 있어서,상기 완충액은 시트레이트, 인산염 및 트리스로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.제 50 항에 있어서,상기 완충액은 라우로콜산 나트륨, SDS 트리톤, Tween(상표명)s, 인지질, 담즙산염, 소듐 데옥시콜레이트 및 소듐 라우릴 설페이트로 구성된 군에서 선택된 제제를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.제 50 항에 있어서,상기 완충액은 EDTA, EGTA 및 시트레이트로 구성된 군에서 선택된 킬레이터를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.제 50 항에 있어서,상기 완충액은 α-메르캅토 에탄올, 아스코르브산염, 소듐 메타비설페이트 및 디티오트레이톨로 구성된 군에서 선택되는 산화방지제를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.제 44 항에 있어서,식물 잎 및 완충액은 200-760㎜Hg의 진공압력으로 가해지는 것을 특징으로 하는 방법.제 54 항에 있어서,상기 진공압력은 400-760㎜Hg인 것을 특징으로 하는 방법.제 54 항에 있어서,상기 진공압력은 740-760㎜Hg인 것을 특징으로 하는 방법.제 54 항에 있어서,상기 진공압력은 760㎜Hg인 것을 특징으로 하는 방법.제 44 항에 있어서,상기 원심분리는 50-5,000×G의 중력 범위에서 진행되는 것을 특징으로 하는 방법.제 44 항에 있어서,상기 원심분리는 약 2,000×G의 중력 범위에서 진행되는 것을 특징으로 하는 방법.제 44항에 있어서,상기 목적 단백질은 재조합 식물 바이러스 벡터에 의해 식물내에서 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.제 44 항에 있어서,상기 목적 단백질은 유전자도입 식물에 의해 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.제 44 항에 있어서,상기 목적 단백질은 식물내에서 자연적으로 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.제 44 항에 있어서,원심분리하기 전에, 조직으로부터 과량의 완충액을 배출시키거나 또는 흡수하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.제 44 항에 있어서,불연속적인 일련의 방법에 의해 완충액으로부터의 조직을 원심분리기로 이동시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.제 44 항에 있어서,원심분리에 의해 간질액을 제거한 후에 남은 조직으로부터 단백질을 정제하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.제 44 항에 있어서,상기 단백질은 원형질 관통막, 페록시좀, 관련 세포막, 기타 세포기관, 핵, 골지체, 세포기질, 조면 및 활면 소포체, 미토콘드리아, 액포 및 엽록체로 구성된 군에서 선택되는 세포성분으로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 방법.(a)완충액에 의해 식물 조직을 침윤시키는 단계;(b)식물 조직과 완충액을 진공환경에 넣는 단계;(c)완충액으로부터 조직을 제거하는 단계;(d)조직을 원심분리하여 간질액을 제거하는 단계; 및(e)간질액으로부터 단백질을 농축시키는 단계로 구성된, 지질, 탄수화물, 지단백질, 다당류, 당, 지방산, 핵산 및 폴리뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택되며, 식물로부터 얻은 생체분자.제 44 항에 있어서,식물조직은 벌크 회전식 진공침윤 탱크에 의해 상기 식물조직에 완충액을 불연속적으로 운반함으로써 상기 완충액에 의해 침윤되는 것을 특징으로 하는 방법.제 44 항에 있어서,상기 침윤은 회전식 입구 및 회전식 배출 밸브를 구비한 내부 오거를 포함하는 원통형 압력용기에 의한 연속식 침윤인 것을 특징으로 하는 방법.제 45 항에 있어서,상기 바스켓 원심분리기는 약 2000-2500×6에서 IF를 추출하기 위해, 저속으로 송출 또는 배출되고, 가속화될 수 있으며, 잎재료는 스플릿 로터 디자인을 통해 배출되는 것을 특징으로 하는 방법.<