초록

본 발명은 적어도 하나 이상의 유전자 활성을 저해하는 무작위 돌연변이를 갖는 세포를 적어도 하나 이상 포함하는 돌연변이 세포의 개체군으로 이루어진 이배체 미생물의 돌연변이 은행에 관한 것으로, 상기 미생물은 반수체 형태로 유도될 수 있다. 좀 더 자세하게는 본 발명은 선택된 표현형에 기여하는 유전자를 동정하기 위해서 돌연변이 은행을 사용하는 방법에 관한 것이다.

대표청구항 ▼

적어도 하나 이상의 유전자의 활성을 파괴하는 돌연변이를 가지는 세포를 적어도 하나 포함하는 돌연변이 세포의 개체군을 포함하며, 이배체이면서 반수체 형태로 유도가능한 미생물의 돌연변이 은행.제 1항에 있어서, 상기 미생물이 일반적으로 반수체 형태로 존재하는 경우 상기 미생물은 먼저 이배체 형태로 유도된 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행.제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 개체군의 복수의 세포는 각각 개별적으로 적어도 하나 이상의 유전자의 활성을 파괴하는 돌연변이를 가지며 따라서 집합적으로 상기 복수의 세포가 게놈내의 복수 유전자에

적어도 하나 이상의 유전자의 활성을 파괴하는 돌연변이를 가지는 세포를 적어도 하나 포함하는 돌연변이 세포의 개체군을 포함하며, 이배체이면서 반수체 형태로 유도가능한 미생물의 돌연변이 은행.제 1항에 있어서, 상기 미생물이 일반적으로 반수체 형태로 존재하는 경우 상기 미생물은 먼저 이배체 형태로 유도된 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행.제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 개체군의 복수의 세포는 각각 개별적으로 적어도 하나 이상의 유전자의 활성을 파괴하는 돌연변이를 가지며 따라서 집합적으로 상기 복수의 세포가 게놈내의 복수 유전자에 돌연변이를 갖는 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행.제 3항에 있어서, 상기 복수 유전자는 게놈 내의 0.001%의 유전자를 차지하는 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행.제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 균류(fungus)인 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행.제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 사상 균류인 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행.제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 A. fumigatus 인 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행.제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 AF300 또는 AF293인 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행.제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 효모인 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행.제 9항에 있어서, 상기 미생물은 C. glabrata 인 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행.제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이는 무작위적으로 유도되는 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행.제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이 은행은 삽입 돌연변이 유발 방법으로 형성되며, 돌연변이를 일으키기 위해 DNA 분자가 각각의 유전자에 삽입되는 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행.제 12항에 있어서, 상기 DNA 분자는 선택 마커인 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행.제 13항에 있어서, 상기 선택 마커는 pyrG 유전자인 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행.제 14항에 있어서, 상기 pyrG 유전자는 A. fumigatus 로부터 유래된 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행.제 14항 또는 제 15항에 있어서, 상기 pyrG 유전자는 플라스미드 상에 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행.제 16항에 있어서, 상기 pyrG를 포함하는 플라스미드는 Aspergillus pyrG 를 포함하는 플라스미드인 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행.제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이는 Agrobacterium의 Ti 플라스미드를 사용하여 유도되는 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행.제 18항에 있어서, 상기 돌연변이는 LBA4404 또는 GV3101 Ti 플라스미드를 사용하여 유도되는 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행.(i) 미생물의 개체군을 배양하는 단계; 및(ii) 이배체이면서 반수체로 유도 가능한 미생물의 게놈 내의 하나 이상의 유전자의 활성을 파괴하는 돌연변이를 상기 개체군의 적어도 하나 이상의 세포에서 유발하는 단계를 포함하는,적어도 하나 이상의 유전자의 활성을 파괴하는 돌연변이를 가지는 세포를 적어도 하나 포함하는 돌연변이 세포의 개체군을 포함하는 미생물의 돌연변이 은행을 제작하는 방법.제 20항에 있어서, 상기 개체군을 배양하기 이전에 미생물이 일반적으로 반수체 형태로 존재하는 경우 상기 미생물은 먼저 이배체 형태로 유도된 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행을 제작하는 방법.제 20항 또는 제 21항에 있어서, 상기 미생물은 균류인 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행을 제작하는 방법.제 20항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 사상 균류인 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행을 제작하는 방법.제 20항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 A. fumigatus 인 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행을 제작하는 방법.제 20항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 AF300 또는 AF293인 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행을 제작하는 방법.제 20항 또는 제 21항에 있어서, 상기 미생물은 효모인 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행을 제작하는 방법.제 26항에 있어서, 상기 미생물은 C. glabrata 인 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행을 제작하는 방법.제 20항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이는 무작위적으로 유도되는 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행을 제작하는 방법.제 20항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이 은행은 삽입 돌연변이 유발 방법으로 형성되며, 돌연변이를 일으키기 위해 DNA 분자가 각각의 유전자에 삽입되는 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행을 제작하는 방법.제 29항에 있어서, 상기 DNA 분자는 선택 마커인 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행을 제작하는 방법.제 30항에 있어서, 상기 선택 마커는 pyrG 유전자인 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행을 제작하는 방법.제 31항에 있어서, 상기 pyrG 유전자는 A. fumigatus 로부터 유래된 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행을 제작하는 방법.제 31항 또는 제 32항에 있어서, 상기 pyrG 유전자는 플라스미드 상에 포함되는 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행을 제작하는 방법.제 33항에 있어서, 상기 pyrG를 포함하는 플라스미드는 Aspergillus pyrG 를 포함하는 플라스미드인 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행을 제작하는 방법.제 33항 또는 제 34항에 있어서, 상기 플라스미드는 일렉트로포레이션에 의해 미생물에 도입되는 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행을 제작하는 방법.제 33항 내지 제 35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라스미드는 도6에서 도시된 것과 같은 pRic3인 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행을 제작하는 방법.제 33항 내지 제 35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라스미드는 도7에서 도시된 것과 같은 ppyrG인 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행을 제작하는 방법.제 33항 내지 제 35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라스미드는 도10에서 도시된 것과 같은 pMB2인 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행을 제작하는 방법.제 33항 내지 제 35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라스미드는 도11에서 도시된 것과 같은 pMB3인 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행을 제작하는 방법.제 20항 내지 39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이배체 미생물은 pyrG- 표현형에 대한 돌연변이인 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행을 제작하는 방법.제 40항에 있어서, 상기 이배체 돌연변이 미생물은:(i) pyrG 표현형을 초래하는 제 1 영양요구성(auxotrophic) 마커를 포함하는 제 1 반수체 돌연변이를 분리하는 단계;(ii) (i) 단계에서 분리된 상기 제 1 반수체 돌연변이를 이용하여, 제 1 pyrG 영양요구성 마커 및 제 2 영양요구성 마커를 포함하는 제 2 반수체 돌연변이를 분리하는 단계;(iii) (i) 단계에서 분리된 상기 제 1 반수체 돌연변이를 이용하여, 제 1 pyrG 영양요구성 마커 및 제 3 영양요구성 마커를 포함하는 제 3 반수체 돌연변이를 분리하는 단계; 및(iv) (ii) 및 (iii) 단계에서 분리된 제 2 및 제 3 반수체 돌연변이를 교배(mating)시켜 pyrG 표현형을 나타내는 이배체 돌연변이를 생산하는 단계에 의해 제작되는 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행을 제작하는 방법.제 41항에 있어서, 상기 제 2 및 제 3 영양요구성 마커를 niaD- 또는 cnx-로부터 선택하는 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행을 제작하는 방법.제 41항 또는 제 42항에 있어서, (iv)단계는 A. fumigatus 에서 이배체 미생물 생산을 위한 프론티어 방법을 사용하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행을 제작하는 방법.제 41항 내지 제 43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반수체 돌연변이를 20-36℃에서 배양하는 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행을 제작하는 방법.제 41항 내지 제 43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반수체 돌연변이를 24-33℃에서 배양하는 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행을 제작하는 방법.제 41항 내지 제 43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반수체 돌연변이를 26-30℃에서 배양하는 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행을 제작하는 방법.제 20항 내지 제 46항 중 어느 한 항에 있어서, 추정 돌연변이 세포를 발생 단계에서 가능한 한 가장 빠른 단계에서 육안으로 실질적으로 볼 수 없는 때에 현미경을 사용하여 동정하는 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행을 제작하는 방법.제 47항에 있어서, 상기 추정 돌연변이 세포를 발생 단계에서 32 내지 48시간이 된 시점에서 동정하는 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행을 제작하는 방법.(i) 각각의 세포가 하나의 유전자의 활성을 파괴하는 돌연변이를 가지는 돌연변이 세포의 개체군으로 이루어지며 상기 개체군은 집합적으로 게놈 내의 모든 유전자에서 돌연변이를 가지는 이배체 미생물의 돌연변이 은행을 제작하는 단계;(ii) 미생물을 반수체 형태로 유도하는 시약에 이배체 미생물을 노출시키는 단계;(iii) 반수체 미생물을 단일 클론으로서 분리 및 배양하는 단계;(iv) 선택된 표현형이 야생형 미생물과 비교하여 변화된 클론을 선택하는 단계; 및(v) 선택된 각각의 클론에서 돌연변이 된 유전자를 동정하는 단계를 포함하는선택된 표현형에 기여하는 미생물의 유전자를 동정하는 방법.제 49항에 있어서, 상기 돌연변이 은행은 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에서 정의한 것이고, 상기 돌연변이 은행은 제 20항 내지 제 48항 중 어느 한 항에서 정의한 방법으로 제작되는 것을 특징으로 하는 방법.A. fumigatus 감염 치료용 의약을 제조하기 위해 서열번호 27을 사용하는 방법.각각의 세포가 한 유전자의 활성을 파괴하는 돌연변이를 가지며, 집합적으로 게놈 내의 모든 유전자에서 돌연변이를 가지는 돌연변이 세포의 개체군으로 이루어지며 반수체 형태로 유도될 수 있는 이배체 미생물의 돌연변이 은행.제 52항에 있어서, 상기 미생물은 A. fumigatus 인 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행.제 53항에 있어서, 상기 미생물은 AF300 또는 AF293인 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행.제 52항에 있어서, 상기 미생물은 C. glabrata 인 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행.제 52항 내지 제 55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이가 Aspergillus pyrG 를 포함하는 플라스미드를 이용하여 유도되는 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행.제 52항 내지 제 56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이는 Agrobacterium의 Ti 플라스미드를 사용하여 유도되는 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행.제 57항에 있어서, 상기 돌연변이는 LBA4404 또는 GV3101의 Ti 플라스미드를 사용하여 유도되는 것을 특징으로 하는 돌연변이 은행.(i) 각각의 세포가 한 유전자의 활성을 파괴하는 돌연변이를 가지며 집합적으로 게놈 내의 모든 유전자에서 돌연변이를 가지는 돌연변이 세포의 개체군으로 이루어지는 이배체 미생물의 돌연변이 은행을 제작하는 단계;(ii) 미생물을 반수체 형태로 유도하는 시약에 상기 이배체 미생물을 노출시키는 단계;(iii) 상기 반수체 미생물을 단일 클론으로서 분리 및 배양하는 단계;(iv) 선택된 표현형이 야생형 미생물과 비교하여 변화된 클론을 선택하는 단계; 및(v) 선택된 각각의 클론에서의 돌연변이 유전자를 동정하는 단계를 포함하는,선택된 표현형에 기여하는 미생물의 유전자를 동정하는 방법.제 59항에 있어서, 상기 돌연변이 은행은 제 52항 내지 제 59항 중 어느 한 항에서 정의된 돌연변이 은행인 것을 특징으로 하는 방법.실시예 및 첨부된 도면을 참고하여 본질적으로 명세서에 기재된, 미생물에서 선택된 표현형에 기여하는 유전자를 동정하는 방법.<