초록

(1) 5'-말단 측에 태그 서열과 3'-말단 측에 세 개 이상의 뉴클레오타이드의 정해진 뉴클레오타이드 서열을 갖는, 각각 태그 서열을 갖는 적어도 두 개의 프라이머 중 각각 하나, 주형 핵산에 특이적인 프라이머와 DNA 중합효소 존재 하에 주형 핵산을 증폭시키고; 위 단계에서 얻은 증폭 단편을 직접 서열분석하는 것:을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산의 염기 서열을 결정하는 방법.

대표청구항 ▼

(1) 각각 태그 서열을 갖는 적어도 두 개의 프라이머 중 각각 하나, 주형 핵산에 특이적인 프라이머와 DNA 중합효소의 존재 하에 주형 핵산을 증폭시키고, 여기서 태그 서열을 갖는 프라이머는 5'-말단 측에 태그 서열과 3'-말단 측에 세 개 이상의 뉴클레오타이드의 정해진 뉴클레오타이드 서열을 가지며;(2) 단계 (1)에서 증폭된 단편을 직접 서열분석하는 것:을 포함하는 핵산의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 방법.제1항에 있어서, 태그 서열을 갖는 프라이머가 하기 일반식으로 표시되는 구조를 갖는 방법:일반식: 5'-태그 서열-Sa

(1) 각각 태그 서열을 갖는 적어도 두 개의 프라이머 중 각각 하나, 주형 핵산에 특이적인 프라이머와 DNA 중합효소의 존재 하에 주형 핵산을 증폭시키고, 여기서 태그 서열을 갖는 프라이머는 5'-말단 측에 태그 서열과 3'-말단 측에 세 개 이상의 뉴클레오타이드의 정해진 뉴클레오타이드 서열을 가지며;(2) 단계 (1)에서 증폭된 단편을 직접 서열분석하는 것:을 포함하는 핵산의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 방법.제1항에 있어서, 태그 서열을 갖는 프라이머가 하기 일반식으로 표시되는 구조를 갖는 방법:일반식: 5'-태그 서열-Sa-3'상기 식에서, "S"는 G, A, T 및 C로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나의 클레오타이드 또는 두 개 이상의 뉴클레오타이드의 혼합물을 나타내고, "a"는 3 이상의 정수를 나타내며, 단 "Sa"에서 적어도 세 개의 S는 G, A, T 및 C로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나의 뉴클레오타이드를 나타낸다.제1항에 있어서, 태그 서열을 갖는 프라이머가 표 1 내지 5에 수록된 프라이머로부터 선택되는 방법.제1항에 있어서, 주형 핵산의 증폭을 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 수행하는 방법.제1항에 있어서, 주형 핵산의 증폭 시 실질적으로 단일-밴드화된 증폭 단편을 생성시키는 태그 서열을 갖는 프라이머 풀을 선별하는 것을 추가로 포함하는 방법.제1항에 있어서, 실질적으로 단일-밴드화된 증폭 단편을 정제하는 것을 추가로 포함하는 방법.제4항에 있어서, PCR에서 pol Ⅰ-타입, α-타입 또는 비-pol Ⅰ, 비-α-타입 DNA 중합효소, 또는 DNA 중합효소의 혼합물을 사용하는 방법.제1항에 있어서, DNA 중합효소가 Taq DNA 중합효소, Pfu DNA 중합효소, Ex-Taq DNA 중합효소, LA-Taq DNA 중합효소, Z-Taq DNA 중합효소, Tth DNA 중합효소, KOD DNA 중합효소 및 KOD dash DNA 중합효소로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.제1항에 있어서, 샘플로부터 주형 핵산을 제조한 후에 수행하는 방법.제9항에 있어서, 주형 핵산이 플라스미드, 파지, 파지미드, 코스미드, BAC 또는 YAC 라이브러리, 또는 게놈 DNA 또는 cDNA 형태로 제공되는 방법.각각 태그 서열을 갖는 적어도 두 개의 프라이머를 함유하고, 여기서 태그 서열을 갖는 프라이머는 5'-말단 측에 태그 서열과 3'-말단 측에 세 개 이상의 뉴클레오타이드의 정해진 뉴클레오타이드 서열을 가지며,(1) 각각 태그 서열을 갖는 적어도 두 개의 프라이머 중 각각 하나, 주형 핵산에 특이적인 프라이머와 DNA 중합효소의 존재 하에 주형 핵산을 증폭시키고, 여기서 태그 서열을 갖는 프라이머는 5'-말단 측에 태그 서열과 3'-말단 측에 세 개 이상의 뉴클레오타이드의 정해진 뉴클레오타이드 서열을 가지며;(2) 단계 (1)에서 증폭된 단편을 직접 서열분석하는 것:을 포함하는 핵산의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 방법에 사용하기 위한 프라이머 풀.제11항에 있어서, 태그 서열을 갖는 프라이머가 하기 일반식으로 표시되는 구조를 갖는 프라이머 풀:일반식: 5'-태그 서열-Sa-3'상기 식에서, "S"는 G, A, T 및 C로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나의 클레오타이드 또는 두 개 이상의 뉴클레오타이드의 혼합물을 나타내고, "a"는 3 이상의 정수를 나타내며, 단 "Sa"에서 적어도 세 개의 S는 G, A, T 및 C로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나의 뉴클레오타이드를 나타낸다.제11항에 있어서, 태그 서열을 갖는 프라이머에 있는 태그 서열이 서열분석을 위한 프라이머 서열을 함유하는 프라이머 풀.각각 태그 서열을 갖는 적어도 두 개의 프라이머를 함유하고, 여기서 태그 서열을 갖는 프라이머는 5'-말단 측에 태그 서열과 3'-말단 측에 세 개 이상의 뉴클레오타이드의 정해진 뉴클레오타이드 서열을 가지며,(1) 각각 태그 서열을 갖는 적어도 두 개의 프라이머 중 각각 하나, 주형 핵산에 특이적인 프라이머와 DNA 중합효소의 존재 하에 주형 핵산을 증폭시키고, 여기서 태그 서열을 갖는 프라이머는 5'-말단 측에 태그 서열과 3'-말단 측에 세 개 이상의 뉴클레오타이드의 정해진 뉴클레오타이드 서열을 가지며;(2) 단계 (1)에서 증폭된 단편을 직접 서열분석하는 것:을 포함하는 핵산의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 방법에 사용되는 프라이머 풀을 함유하는, 핵산의 뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위한 조성물.제14항에 있어서, DNA 중합효소를 추가로 함유하는 조성물.제15항에 있어서, DNA 중합효소가 pol Ⅰ-타입, α-타입 또는 비-pol Ⅰ, 비-α-타입 DNA 중합효소, 또는 DNA 중합효소의 혼합물인 조성물.제16항에 있어서, DNA 중합효소가 Taq DNA 중합효소, Ex-Taq DNA 중합효소, LA-Taq DNA 중합효소, Z-Taq DNA 중합효소, Tth DNA 중합효소, KOD DNA 중합효소 및 KOD dash DNA 중합효소로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 조성물.각각 태그 서열을 갖는 적어도 두 개의 프라이머를 함유하는 프라이머 풀을 함유하고, 여기서 태그 서열을 갖는 프라이머는 5'-말단 측에 태그 서열과 3'-말단 측에 세 개 이상의 뉴클레오타이드의 정해진 뉴클레오타이드 서열을 가지며,(1) 각각 태그 서열을 갖는 적어도 두 개의 프라이머 중 각각 하나, 주형 핵산에 특이적인 프라이머와 DNA 중합효소의 존재 하에 주형 핵산을 증폭시키고, 여기서 태그 서열을 갖는 프라이머는 5'-말단 측에 태그 서열과 3'-말단 측에 세 개 이상의 뉴클레오타이드의 정해진 뉴클레오타이드 서열을 가지며;(2) 단계 (1)에서 증폭된 단편을 직접 서열분석하는 것:을 포함하는 핵산의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 방법에 사용되는 키트.제18항에 있어서, DNA 중합효소와 DNA 중합효소를 위한 완충액을 추가로 함유하는 키트.포장된 형태이고,각각 태그 서열을 갖는 적어도 두 개의 프라이머를 함유하는 프라이머 풀과 DNA 중합효소의 사용을 지시하는 지침을 함유하며, 여기서 태그 서열을 갖는 프라이머는 5'-말단 측에 태그 서열과 3'-말단 측에 세 개 이상의 뉴클레오타이드의 정해진 뉴클레오타이드 서열을 갖고,(1) 각각 태그 서열을 갖는 적어도 두 개의 프라이머 중 각각 하나, 주형 핵산에 특이적인 프라이머와 DNA 중합효소의 존재 하에 주형 핵산을 증폭시키고, 여기서 태그 서열을 갖는 프라이머는 5'-말단 측에 태그 서열과 3'-말단 측에 세 개 이상의 뉴클레오타이드의 정해진 뉴클레오타이드 서열을 가지며;(2) 단계 (1)에서 증폭된 단편을 직접 서열분석하는 것:을 포함하는 핵산의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 방법에 사용되는 키트.제18항 또는 제20항에 있어서, 프라이머 풀 중의 각각 태그 서열을 갖는 각각의 프라이머가 예정된 위치에 분배되어 있는 키트.포장재와, 포장재에 봉입된 프라이머 풀 및/또는 DNA 중합효소를 함유하는 핵산의 뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위한 시약으로 구성되고, 시약을 뉴클레오타이드 서열 결정에 사용할 수 있다는 기재가 포장재에 부착된 라벨이나 포장재에 부착된 지침에 표시되어 있는 제조품.<