초록 ▼

진핵 세포에 있는 내인성 유전자 및 염색체 유전자좌를 상동성 재조합을 통해 표적화하고, 어떤 바람직한 방식으로 변형시키기 위해 거대 DNA 벡터를 엔지니어링 및 사용하는 방법이다. 다른 접근법에 의해 사용된 것들보다 더 큰 클로닝된 게놈 DNA의 단편으로부터 유래되어 LTVECs로 명명된, 진핵 세포에 대한 이들 거대 DNA 표적화 벡터는 진핵 세포에서 상동성 표적화를 수행하도록 의도된다. 또한 LTVEC가 원하는 내인성 유전자(군) 또는 염색체 유전자좌(군)을 올바르게 표적화하고 변형시킨 진핵 세포의 검출을 위한 신속하고 편리

진핵 세포에 있는 내인성 유전자 및 염색체 유전자좌를 상동성 재조합을 통해 표적화하고, 어떤 바람직한 방식으로 변형시키기 위해 거대 DNA 벡터를 엔지니어링 및 사용하는 방법이다. 다른 접근법에 의해 사용된 것들보다 더 큰 클로닝된 게놈 DNA의 단편으로부터 유래되어 LTVECs로 명명된, 진핵 세포에 대한 이들 거대 DNA 표적화 벡터는 진핵 세포에서 상동성 표적화를 수행하도록 의도된다. 또한 LTVEC가 원하는 내인성 유전자(군) 또는 염색체 유전자좌(군)을 올바르게 표적화하고 변형시킨 진핵 세포의 검출을 위한 신속하고 편리한 방법은 물론이고 유전적 변형을 갖는 생물을 생성하기 위한 이들 세포의 사용이 제공된다.

대표청구항 ▼

a) 관심있는 DNA 서열을 함유한 거대 클로닝 게놈 단편을 획득하는 단계; b) 박테리아 상동성 재조합을 이용하여 진핵 세포에서의 사용을 위한 거대 표적화 벡터 (LTVEC)를 제작하기 위해 (a)의 거대 클로닝 게놈 단편을 유전적으로 변형하는 단계; c) (b)의 LTVEC를 진핵 세포 내로 도입하여 세포에서 내인성 유전자 또는 염색체 유전자좌를 변형시키는 단계; 및d) 정량 검정을 이용하여 내인성 유전자 또는 염색체 유전자좌가 유전적으로 변형된 이들 진핵 세포를 확인하기 위해 (c)의 진핵 세포에서 대립유전자의 변형 (MOA)

a) 관심있는 DNA 서열을 함유한 거대 클로닝 게놈 단편을 획득하는 단계; b) 박테리아 상동성 재조합을 이용하여 진핵 세포에서의 사용을 위한 거대 표적화 벡터 (LTVEC)를 제작하기 위해 (a)의 거대 클로닝 게놈 단편을 유전적으로 변형하는 단계; c) (b)의 LTVEC를 진핵 세포 내로 도입하여 세포에서 내인성 유전자 또는 염색체 유전자좌를 변형시키는 단계; 및d) 정량 검정을 이용하여 내인성 유전자 또는 염색체 유전자좌가 유전적으로 변형된 이들 진핵 세포를 확인하기 위해 (c)의 진핵 세포에서 대립유전자의 변형 (MOA)을 검출하는 단계를 포함하는, 진핵 세포에서 관심있는 내인성 유전자 또는 염색체 유전자좌를 유전적으로 변형시키는 방법.제 1 항에 있어서, DNA 서열을 함유한 거대 클로닝 게놈 단편은 관심있는 내인성 유전자 또는 염색체 유전자좌에 상동성인 것을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서, 내인성 유전자 또는 염색체 유전자좌의 유전적 변형은 코딩 서열, 유전자 세그먼트, 또는 조절 요소의 결실; 코딩 서열, 유전자 세그먼트 또는 조절 요소의 변경; 새로운 코딩 서열, 유전자 세그먼트, 또는 조절 요소의 삽입; 조건 대립유전자의 제작; 또는 한 종으로부터 유래된 코딩 서열 또는 유전자 세그먼트의 동일하거나 상이한 종으로부터 유래된 상동성 또는 오르토로고스 코딩 서열로의 대치를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.제 3 항에 있어서, 코딩 서열, 유전자 세그먼트, 또는 조절 요소의 변경은 치환, 부가, 또는 융합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.제 4 항에 있어서, 융합은 에피토프 태그 또는 2작용 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서, 정량 검정은 정량 PCR, FISH, 비교 게놈 혼성화, 등온 DNA 증폭, 고정된 프로브로의 정량 혼성화, Invader Probes®, 또는 MMP assays®를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.제 6 항에 있어서, 정량 PCR은 TaqMan®, Molecular Beacon, 또는 Eclipse™ 프로브 기술을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서, 진핵 세포는 포유 동물 배아 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 방법.제 8 항에 있어서, 배아 줄기 세포는 마우스, 래트, 또는 다른 설치류의 배아 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서, 내인성 유전자 또는 염색체 유전자좌는 포유 동물의 유전자 또는 염색체 유전자좌인 것을 특징으로 하는 방법.제 10 항에 있어서, 내인성 유전자 또는 염색체 유전자좌는 인간의 유전자 또는 염색체 유전자좌인 것을 특징으로 하는 방법.제 10 항에 있어서, 내인성 유전자 또는 염색체 유전자좌는 마우스, 래트, 또는 다른 설치류의 유전자 또는 염색체 유전자좌인 것을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서, LTVEC는 20 kb 보다 더 큰 거대 DNA 단편을 수용할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.제 13 항에 있어서, LTVEC는 100 kb 보다 더 큰 거대 DNA 단편을 수용할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.a) 관심있는 DNA 서열을 함유한 20 kb 이상의 거대 클로닝 게놈 단편을 획득하는 단계 (여기에서 거대 클로닝 DNA 단편은 내인성 유전자 또는 염색체 유전자좌에 상동성이다);b) 박테리아 상동성 재조합을 이용하여 마우스 배아 줄기 세포에서의 사용을 위한 거대 표적화 벡터를 제작하기 위해 (a)의 거대 클로닝 게놈 단편을 유전적으로 변형시키는 단계 (여기에서 유전적 변형은 코딩 서열, 유전자 세그먼트, 또는 조절 요소의 결실이다);c) (b)의 거대 표적화 벡터를 마우스 배아 줄기 세포 내로 도입하여 세포에서 내인성 유전자 또는 염색체 유전자좌를 변형시키는 단계; 및 d) 정량 검정을 이용하여 내인성 유전자 또는 염색체 유전자좌가 유전적으로 변형된 이들 마우스 배아 줄기 세포를 확인하기 위해 (c)의 마우스 배아 줄기 세포에서 대립유전자의 변형 (MOA)을 검출하는 단계 (여기에서 정량 검정은 정량 PCR이다)를 포함하는, 마우스 배아 줄기 세포에서 관심있는 내인성 유전자 또는 염색체 유전자좌를 유전적으로 변형시키는 방법.제 1 항 또는 15 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 유전적으로 변형된 내인성 유전자 또는 염색체 유전자좌.제 16 항에 있어서, 내인성 유전자 또는 염색체 유전자좌의 유전적 변형은 코딩 서열, 유전자 세그먼트, 또는 조절 요소의 결실; 코딩 서열, 유전자 세그먼트 또는 조절 요소의 변경; 새로운 코딩 서열, 유전자 세그먼트, 또는 조절 요소의 삽입; 조건 대립유전자의 제작; 또는 한 종으로부터 유래된 코딩 서열 또는 유전자 세그먼트의 동일하거나 상이한 종으로부터 유래된 상동성 또는 오르토로고스 코딩 서열로의 대치를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 내인성 유전자 또는 염색체 유전자좌.제 17 항에 있어서, 코딩 서열, 유전자 세그먼트, 또는 조절 요소의 변경은 치환, 부가, 또는 융합을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 내인성 유전자 또는 염색체 유전자좌.제 18 항에 있어서, 융합은 에피토프 태그 또는 2작용 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 내인성 유전자 또는 염색체 유전자좌.제 1 항의 방법에 의해 생산된 유전적으로 변형된 진핵 세포.제 15 항의 방법에 의해 생산된 유전적으로 변형된 마우스 배아 줄기 세포.제 20 항에 있어서, 내인성 유전자 또는 염색체 유전자좌의 유전적 변형은 코딩 서열, 유전자 세그먼트, 또는 조절 요소의 결실; 코딩 서열, 유전자 세그먼트 또는 조절 요소의 변경; 새로운 코딩 서열, 유전자 세그먼트, 또는 조절 요소의 삽입; 조건 대립유전자의 제작; 또는 한 종으로부터 유래된 코딩 서열 또는 유전자 세그먼트의 동일하거나 상이한 종으로부터 유래된 상동성 또는 오르토로고스 코딩 서열로의 대치를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 진핵 세포.제 22 항에 있어서, 코딩 서열, 유전자 세그먼트, 또는 조절 요소의 변경은 치환, 부가, 또는 융합을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 진핵 세포.제 23 항에 있어서, 융합은 에피토프 태그 또는 2작용 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 진핵 세포.제 1 항의 방법에 의해 생산된 유전적으로 변형된 내인성 유전자 또는 염색체 유전자좌를 함유하는 비-인간 생물.제 15 항의 방법에 의해 생산된 유전적으로 변형된 내인성 유전자 또는 염색체 유전자좌를 함유하는 마우스.제 20 항, 제 22 항, 제 23 항, 또는 제 24 항 중 어느 한 항의 유전적으로 변형된 진핵 세포로부터 생산된 비-인간 생물.제 21 항의 유전적으로 변형된 마우스 배아 줄기 세포로부터 생산된 마우스.제 1 항의 방법에 의해 생산된 유전적으로 변형된 배아 줄기 세포.제 29 항에 있어서, 내인성 유전자 또는 염색체 유전자좌의 유전적 변형은 코딩 서열, 유전자 세그먼트, 또는 조절 요소의 결실; 코딩 서열, 유전자 세그먼트 또는 조절 요소의 변경; 새로운 코딩 서열, 유전자 세그먼트, 또는 조절 요소의 삽입; 조건 대립유전자의 제작; 또는 한 종으로부터 유래된 코딩 서열 또는 유전자 세그먼트의 상이한 종으로부터 유래된 상동성 또는 오르토로고스 코딩 서열로의 대치를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 배아 줄기 세포.제 30 항에 있어서, 코딩 서열, 유전자 세그먼트, 또는 조절 요소의 변경은 치환, 부가, 또는 융합을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 배아 줄기 세포.제 31 항에 있어서, 융합은 에피토프 태그 또는 2작용 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 배아 줄기 세포.a) 관심있는 DNA 서열을 함유한 거대 클로닝 게놈 단편을 획득하는 단계; b) 박테리아 상동성 재조합을 이용하여 배아 줄기 세포에서의 사용을 위한 거대 표적화 벡터 (LTVEC)를 제작하기 위해 (a)의 거대 클로닝 게놈 단편을 유전적으로 변형하는 단계; c) (b)의 LTVEC를 배아 줄기 세포 내로 도입하여 세포에서 내인성 유전자 또는 염색체 유전자좌를 변형시키는 단계; d) 정량 검정을 이용하여 내인성 유전자 또는 염색체 유전자좌가 유전적으로 변형된 이들 배아 줄기 세포를 확인하기 위해 (c)의 배아 줄기 세포에서 대립유전자의 변형 (MOA)을 검출하는 단계; e) (d)의 배아 줄기 세포를 배반포에 도입하는 단계; 및f) (e)의 배반포를 임신을 위하여 대리모 내로 도입하는 단계를 포함하는 방법에 의해서 생산된, 관심있는 내인성 유전자 또는 염색체 유전자좌를 함유하는 비-인간 생물.a) 관심있는 DNA 서열을 함유한 20 kb 이상의 거대 클로닝 게놈 단편을 획득하는 단계 (여기에서 거대 클로닝 DNA 단편은 내인성 유전자 또는 염색체 유전자좌에 상동성이다);b) 박테리아 상동성 재조합을 이용하여 마우스 배아 줄기 세포에서의 사용을 위한 거대 표적화 벡터를 제작하기 위해 (a)의 거대 클로닝 게놈 단편을 유전적으로 변형시키는 단계 (여기에서 유전적 변형은 코딩 서열, 유전자 세그먼트, 또는 조절 요소의 결실이다);c) (b)의 거대 표적화 벡터를 마우스 배아 줄기 세포 내로 도입하여 세포에서 내인성 유전자 또는 염색체 유전자좌를 변형시키는 단계; 및 d) 정량 검정을 이용하여 내인성 유전자 또는 염색체 유전자좌가 유전적으로 변형된 이들 마우스 배아 줄기 세포를 확인하기 위해 (c)의 마우스 배아 줄기 세포에서 대립유전자의 변형 (MOA)을 검출하는 단계 (여기에서 정량 검정은 정량 PCR이다);e) (d)의 마우스 배아 줄기 세포를 배반포 내로 도입하는 단계; 및f) (e)의 배반포를 임신을 위하여 대리모 내로 도입하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생산된, 유전적으로 변형된 관심있는 내인성 유전자 또는 염색체 유전자좌를 함유하는 마우스.a) 관심있는 DNA 서열을 함유한 거대 클로닝 게놈 단편을 획득하는 단계; b) 박테리아 상동성 재조합을 이용하여 진핵 세포에서의 사용을 위한 거대 표적화 벡터 (LTVEC)를 제작하기 위해 (a)의 거대 클로닝 게놈 단편을 유전적으로 변형하는 단계; c) (b)의 LTVEC를 진핵 세포 내로 도입하여 세포에서 내인성 유전자 또는 염색체 유전자좌를 유전적으로 변형시키는 단계; d) 정량 검정을 이용하여 내인성 유전자 또는 염색체 유전자좌가 유전적으로 변형된 이들 진핵 세포를 확인하기 위해 (c)의 진핵 세포에서 대립유전자의 변형 (MOA)을 검출하는 단계; e) (d)의 진핵 세포로부터 핵을 제거하는 단계; f) (e)의 핵을 난세포 내로 도입하는 단계; 및 g) (f)의 난세포를 임신을 위한 대리모 내로 도입하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생산된, 유전적으로 변형된 내인성 유전자 또는 염색체 유전자좌를 함유하는 비-인간 생물.a) 관심있는 DNA 서열을 함유한 거대 클로닝 게놈 단편을 획득하는 단계; b) 박테리아 상동성 재조합을 이용하여 진핵 세포에서의 사용을 위한 거대 표적화 벡터 (LTVEC)를 제작하기 위해 (a)의 거대 클로닝 게놈 단편을 유전적으로 변형하는 단계; c) (b)의 LTVEC를 진핵 세포 내로 도입하여 세포에서 내인성 유전자 또는 염색체 유전자좌를 유전적으로 변형시키는 단계; d) 정량 검정을 이용하여 내인성 유전자 또는 염색체 유전자좌가 유전적으로 변형된 이들 진핵 세포를 확인하기 위해 (c)의 진핵 세포에서 대립유전자의 변형 (MOA)을 검출하는 단계;e) (d)의 진핵 세포를 또다른 진핵 세포와 융합시키는 단계; 및f) (e)의 융합된 진핵 세포를 임신을 위해 대리모 내로 도입하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생산된, 유전적으로 변형된 내인성 유전자 또는 염색체 유전자좌를 함유하는 비-인간 생물.제 33 항, 제 35 항, 또는 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서, DNA 서열을 함유하는 거대 클로닝 게놈 단편은 관심있는 내인성 유전자 또는 염색체 유전자좌에 상동성인 것을 특징으로 하는 비-인간 생물.제 25 항, 제 33 항, 제 35 항, 또는 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서, 비-인간 생물은 마우스, 래트, 또는 다른 설치류인 것을 특징으로 하는 비-인간 생물.제 33 항에 있어서, 배반포는 마우스, 래트, 또는 다른 설치류의 배반포인 것을 특징으로 하는 비-인간 생물.제 35 항에 있어서, 난세포는 마우스, 래트, 또는 다른 설치류의 난세포인 것을 특징으로 하는 비-인간 생물.제 33 항, 제 35 항, 또는 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서, 대리모는 마우스, 래트, 또는 다른 설치류인 것을 특징으로 하는 비-인간 생물.제 33 항에 있어서, 배아 줄기 세포는 포유 동물의 배아 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 비-인간 생물.제 42 항에 있어서, 포유 동물의 배아 줄기 세포는 마우스, 래트, 또는 다른 설치류의 배아 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 비-인간 생물.제 33 항, 제 35 항, 또는 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 유전자 또는 염색체 유전자좌의 유전적 변형은 코딩 서열, 유전자 세그먼트, 또는 조절 요소의 결실; 코딩 서열, 유전자 세그먼트 또는 조절 요소의 변경; 새로운 코딩 서열, 유전자 세그먼트, 또는 조절 요소의 삽입; 조건 대립유전자의 제작; 또는 한 종으로부터 유래된 코딩 서열 또는 유전자 세그먼트의 동일하거나 상이한 종으로부터 유래된 상동성 또는 오르토로고스 코딩 서열로의 대치를 포함하는 것을 특징으로 하는 비-인간 생물.제 44 항에 있어서, 코딩 서열, 유전자 세그먼트, 또는 조절 요소의 변경은 치환, 부가, 또는 융합을 포함하는 것을 특징으로 하는 비-인간 생물.제 45 항에 있어서, 융합은 에피토프 태그 또는 2작용 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 비-인간 생물.제 33 항, 제 35 항, 또는 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서, 정량 검정은 정량 PCR, FISH, 비교 게놈 혼성화, 등온 DNA 증폭, 고정된 프로브로의 정량 혼성화, Invader Probes®, 또는 MMP assays®를 포함하는 것을 특징으로 하는 비-인간 생물.제 47 항에 있어서, 정량 PCR은 TaqMan®, Molecular Beacon, 또는 Eclipse™ 프로브 기술을 포함하는 것을 특징으로 하는 비-인간 생물.비-인간 생물의 생산을 위해 제 20 항의 유전적으로 변형된 진핵 세포의 사용.마우스의 생산을 위해 제 21 항의 유전적으로 변형된 마우스 배아 줄기 세포의 사용.비-인간 생물의 생산을 위해 유전적으로 변형된 배아 줄기 세포의 사용.제 1 항 또는 제 15 항에 부어서, 약 1 내지 5 ㎍의 (c)의 거대 표적화 벡터가 약 1 x 107 세포로 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.제 34 항에 있어서, 약 1 내지 5 ㎍의 (c)의 거대 표적화 벡터가 약 1 x 107 세포로 도입되는 것을 특징으로 하는 마우스.제 33 항, 제 35 항, 또는 제 36 항에 있어서, 약 1 내지 5 ㎍의 (c)의 거대 표적화 벡터가 약 1 x 107 세포로 도입되는 것을 특징으로 하는 비-인간 생물.<