초록

본 발명은 향상된 스크리닝 방법에 관한 것으로, 상세하게는, 차등적으로 그리고/또는 저빈도로 발현되는 리간드에 특이적인 항-리간드를 식별하기 위한 항-리간드 라이브러리 스크리닝 방법에 관한 것이다.

대표청구항 ▼

적어도 하나의 차등-발현된 표적 리간드에 대한 적어도 하나의 항-리간드를 분리하는 방법으로서, 상기 항-리간드는 폴리펩타이드이며, 상기 표적 리간드는 세포 표면 항원이며, 상기 차등-발현된 표적 리간드는 저 발현된 리간드이며, 상기 저 발현된 리간드는 세포당 5,000 내지 20,000 사이의 복제수(copies)로 발현되며,(a) 항-리간드의 라이브러리에서 차등 바이오패닝을 수행하여 적어도 하나의 항-리간드를 분리하는 단계로서, 여기서 차등 바이오패닝 단계는 (i) 항-리간드의 라이브러리를 제공하는 단계;(ii) 서브트랙터 리간드

적어도 하나의 차등-발현된 표적 리간드에 대한 적어도 하나의 항-리간드를 분리하는 방법으로서, 상기 항-리간드는 폴리펩타이드이며, 상기 표적 리간드는 세포 표면 항원이며, 상기 차등-발현된 표적 리간드는 저 발현된 리간드이며, 상기 저 발현된 리간드는 세포당 5,000 내지 20,000 사이의 복제수(copies)로 발현되며,(a) 항-리간드의 라이브러리에서 차등 바이오패닝을 수행하여 적어도 하나의 항-리간드를 분리하는 단계로서, 여기서 차등 바이오패닝 단계는 (i) 항-리간드의 라이브러리를 제공하는 단계;(ii) 서브트랙터 리간드(subtractor ligand) 구조물에 고정되거나 편입된 리간드를 포함하는 제 1 리간드 집단을 제공하는 단계;(iii) 표적 리간드 구조물에 고정되거나 편입된, 단계 (ii)에서와 동일한 리간드를 포함하는 제 2 리간드 집단을 제공하는 단계;(iv) 차등적으로 발현된 표적 리간드에 대한 항-리간드의 분리가 가능하도록 질량 작용의 보편적 법칙 로부터 유도된 하나 이상의 식을 이용하여 상기 집단들에서 서브트랙터 리간드 구조물 및 표적 리간드 구조물의 양을 측정하는 단계로서,상기 식에서:A, B, C 및 D = 반응에서의 참여물(반응물 및 생성물)a, b, c 및 d = 밸런스드 화학 방정식에 필요한 계수이며,여기서 상기 식은(여기서bA = 바인딩된 항-리간드A = 항-리간드의 총수T = 리간드의 총수C = 아보가드로 상수(6.022 x 1023 파티클/몰)V = 반응 부피(리터)Kd = 평형 해리 상수)또는(여기서bAp = 바인딩된 항-리간드Tp = Cp에서 리간드의 수Ts = Cs에서 리간드의 수Cp = 표적 리간드 구조물의 수Cs = 서브트랙터 리간드 구조물의 수A = 항-리간드의 총수T = 리간드의 총수C = 아보가드로 상수(6.022 x 1023 파티클/몰)V = 반응 부피(리터)Kd = 평형 해리 상수)인, 서브트랙터 리간드 구조물 및 표적 리간드 구조물의 양을 측정하는 단계;(v) 단계 (iv)에서 측정된 서브트랙터 리간드 구조물의 양을 제공하는 단계;(vi) 단계 (iv)에서 측정된 표적 리간드 구조물의 양을 제공하는 단계;(vii) 서브트랙터 리간드 구조물에 바인딩된 항-리간드로부터 표적 리간드 구조물에 바인딩된 항-리간드를 분리하는 분리 수단을 제공하는 단계;(viii) (v) 및 (vi)에 의해 제공된 리간드 구조물에 (i)의 라이브러리를 노출시켜 리간드에 항-리간드를 바인딩시키는 단계; 및(ix) 상기 분리 수단을 이용하여 상기 표적 리간드 구조물에 고정되거나 편입된 리간드에 바인딩된 항-리간드를 분리하는 단계의 보조 단계들을 포함하는, 단계;(b) 단계 (a) 중에 분리된 항-리간드에서 고 처리 시퀀싱(high throughput sequencing)을 수행하는 단계; 및(c) 차등적으로-발현된 리간드에 대한 항체 특이성에 대한 확인 스크리닝을 수행하는 단계를 포함하는, 적어도 하나의 차등-발현된 표적 리간드에 대한 적어도 하나의 항-리간드를 분리하는 방법.