초록 ▼

인터루킨-2(IL-2)는 인체 면역반응계의 여러가지 인자 중 중요한 것 중의 하나이며,인체의 T세포에서 미량 분비된다. IL-2는 말기암 환자 치료에 상당한 효과가 있다고 보고 되었으며,임상에 이용하기 위하여는 유전자 재조합 방법에 의하여 값싸게 대량 생산하는 것이 필요하다. 이를 위하여는 생산벡터,균주개선,발현 최적조건 연구,정제 방법 등의 연구가 필요하다. 본 연구에서는 tetracyclim에 대한 내성을 지닌 pILBR plasmid를 제조하였으며,IL-2생산 효율은 20%였다. 그러나 이 균주는 성장속도가 미약하고 안정성이

인터루킨-2(IL-2)는 인체 면역반응계의 여러가지 인자 중 중요한 것 중의 하나이며,인체의 T세포에서 미량 분비된다. IL-2는 말기암 환자 치료에 상당한 효과가 있다고 보고 되었으며,임상에 이용하기 위하여는 유전자 재조합 방법에 의하여 값싸게 대량 생산하는 것이 필요하다. 이를 위하여는 생산벡터,균주개선,발현 최적조건 연구,정제 방법 등의 연구가 필요하다. 본 연구에서는 tetracyclim에 대한 내성을 지닌 pILBR plasmid를 제조하였으며,IL-2생산 효율은 20%였다. 그러나 이 균주는 성장속도가 미약하고 안정성이 낮았다. 배지는 FYEI배지가 유용하고,30℃에서 배양 42℃에서 induction 다시 30℃배양이 높은 IL-2 생산 효율을 나타내었다. S(upper 125)-mutein과 wild type의 IL-2 생산량은 비슷하였다. 정제는 10L 배양시에 1g의 순수 재조합 단백질이 정제되었으며 순도는 99%이상이었다. 또한 아미노 말단은 20%Met 이고 80%가 Ala 이었다. 또한 저장도중 거의 분해되지 않는 안정성을 나타내었다.

목차 Contents

• 제1장 총론...24
• 제2장 재조합 interleukin-2의 효율적생산을 위한 유전자 조작...25
• 제1절 서론...25
• 제2절 실험재료 및 방법...27
• 1. 실험재료...27
• 2. Plasmid pILBR의 제조...28
• 3. Plasmid pILBT의 제조...28
• 4. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis에 의한 전체 단백질 분석...30
• 5. IL-2의 생물학적 활성 검정...32
• 제3절 결과 및 고찰...33
• 1. Plasmid pILBR을 이용한 IR-2의 생산...33
• 2. Plasmid pILBT을 이용한 IR-2의 생산...36
• 제4절 결론 및 건의사항...37
• 제5절 참고문헌...38
• 제3장 재조합 미생물을 이용한 interleukin-2 생산에 관한 연구...39
• 제1절 서론...39
• 1. 인터루킨-2...39
• 2. 재조합 미생물의 발효공정 설계...50
• 제2절 실험재료 및 방법...53
• 1. 재조합균주...53
• 2. 배양배지...53
• 3. 배양방법...56
• 가. 플라스크 배양...56
• 나. 발효조 배양...56
• 4. 분석방법...57
• 가. 균체 및 세포활성도 측정...57
• 나. 포도당...57
• 다. 단백질 측정...58
• 라. 앰피실린 측정...58
• 마. β-Lactamase 활성 측정...59
• 바. 재조합 세포의 안정성(Stability) 측정...60
• 사. 인터루킨-2의 측정...61
• 제3절 결과 및 고찰...65
• 1. 배지설계...65
• 가. 배지에 따른 세포증식, 당소모 및 안정성연구...65
• 나. 배지에 따른 IL-2 생성...70
• 2. 유도시기(induction time)의 영향...75
• 3. 재조합 균주의 안정성...78
• 가. 앰피실린 첨가영향...80
• 나. 균주에 따른 안정성...84
• 다. 재조합세포의 morphology 변화...84
• 4. 균주에 따른 IL-2 생성...89
• 5. 조업조건에 따른 IL-2 생성관련인자의 변화...91
• 가. 세포성장...92
• 나. 단백질 생성...92
• 다. 세포 활성도...95
• 라. 플라즈미드 안정성...97
• 마. 인터루킨-2 생성...99
• 제4절 결론...103
• 제5절 참고문헌...106
• 제4장 재조합 인체 인터루킨-2의 대량정제 및 생화학적 특성 연구...109
• 제1절 서론...109
• 제2절 실험재료 및 방법...110
• 1. 재조합 인체 인터루킨-2의 분리 및 정제...110
• 2. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis...112
• 3. 아미노 말단 아미노산의 분석...113
• 4. 아미노산 서열 분석...113
• 5. 재조합 인터루킨-2의 생물학적 활성도 측정...114
• 제3절 결과 및 고찰...114
• 제4절 결론...128
• 제5절 참고문헌...129
• 제5장 Interleukin-2의 단일클론항체 생성에 관한 연구...133
• 제1절 서론...133
• 제2절 실험재료 및 방법...136
• 1. IL-2 단백질 항원에 대한 Balb/c mouse의 면역화...136
• 2. 면역화된 mouse로 부터 spleen cell의 분리...137
• 3. Mouse myeloma cell(SP 2/0)의 배양...138
• 4. Myeloma세포와 spleen세포의 융합...138
• 가. 시약 및 기구...138
• 나. 융합방법 및 절차...139
• 제3절 결과 및 고찰...142
• 제4절 결론...142
• 제5절 참고문헌...143
• 부록...144