초록 ▼

우리나라의 신증후성 출혈열의 원인 바이러스인 Hantavirus의 외피 당단백을 생산하는 M segment를 유전자 재조합 기술을 이용하여 다량 생산함으로써, 이를 이용 체액성 면역반응 및 세포성 면역반응에 대한 유발능을 중화항체유도능 및 T cell clone등을 통해 분석하고 방어항원 결정기 분석을 통해 백신 및 진단법에 이용할 수 있는 기반기초적 자료를 제공하고자 연구를 시행하였다. PCRTM cloning vector (invitrogen 社, cat No. k2000-01, 3.9kb)에 들어 있는 Hantaan M s

우리나라의 신증후성 출혈열의 원인 바이러스인 Hantavirus의 외피 당단백을 생산하는 M segment를 유전자 재조합 기술을 이용하여 다량 생산함으로써, 이를 이용 체액성 면역반응 및 세포성 면역반응에 대한 유발능을 중화항체유도능 및 T cell clone등을 통해 분석하고 방어항원 결정기 분석을 통해 백신 및 진단법에 이용할 수 있는 기반기초적 자료를 제공하고자 연구를 시행하였다. PCRTM cloning vector (invitrogen 社, cat No. k2000-01, 3.9kb)에 들어 있는 Hantaan M segment의 cDNA를 template로 사용하여 G1 cDNA (Hantaan virus의 외피 당단백 G1 protein을 발현하는 mRNA의 cDNA) 와 G2 cDNA를 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 이용하여 제작하였다. 또한 PCRTM cloning vector에 들어있는 Hantaan M segment를 BanⅠ제한효소로 자른 후 얻어진 fragment (M segment 中 212bp ∼ 3,283bp 였다(3,072bps))를 klenow fragment로 filling하여 G1과 G2 양쪽을 다 포함하는 insert를 제작하였으며 이렇게 제작된 cDNA를 대장균(XL1-blue, DH5)내에서 유전자 재조합 기술을 이용해 transformation 시켜 G1 cDNA clone을 9개, G2 cDNA clone을 7개 그리고 pbM(3.1kbps fragment) clone을 11개 제조하였다. 이들에 대한 항원의 expression을 진행시키고 있으며 제조된 항원을 이용해 T cell cloning 및 중화항체 유발능을 분석할 예정이다. 본 연구는 한탄바이러스 감염에 대한 세포성 면역 반응 및 체액성 면역반응에 대해 효과적으로 면역능을 유발하는 재조합 항원을 다량 생산하는 연구로 vaccine개발에도 큰 도움을 줄 것으로 기대된다.

목차 Contents

• 제 1 장 서론...11
• 제 2 장 연구목적...13
• 제 3 장 연구배경 및 필요성...15
• 제 4 장 연구 재료 및 방법...19
• 제 1 절 Insert 준비...19
• 1. $PCB^{TM}$ cloning vector에 G1-G2 cDNA의 cloning...19
• 가. $PCB^{TM}$ cloning vector에 G1-G2 cDNA의 ligation...19
• 나. $PCB^{TM}$ cloning vector + M segment ligant test...20
• 2. Gl cDNA, G2 cDNA 제작...20
• 가. PCR(Polymerase chain reaction)를 이용한 G1 cDNA, G2 cDNA 제작...20
• 나. G1 cDNA 및 G2 cDNA 확인검사...21
• 3. pbM 제작...22
• 가. $PCR^{TM}$ cloning vector(including M segment) 를 Ban I으로 절단...22
• 나. klenow 처리...22
• 다. pBluescript 와 bM(M segment를 Ban I으로 cutting 한 후 filling한 절편)의 ligatio...23
• 라. transformation for pBluescript + bM ligant by electroporation...23
• 마. pBluescript + bM ligant 를 이용한 pbM 제작...24
• 제 2 절 Expression vector 준비...25
• 1. large-scale preparations of plasmid DNA...25
• 2. 추출한 vector들에 대한 확인 검사...27
• 제 3 절 Transformation...27
• 1. 제한효소를 이용한 insert와 vector의 절단...27
• 2. ligation...29
• 3. Trasformation by electorporation...31
• 가. ligation mixture의 완충액 교환...31
• 나. electroporation 用 competent cell 제작...31
• 다. electorporation에 의한 trasformation...31
• 라. $\alpha$ - Complementation을 이용한 집락 검색...32
• 마. 제한효소 절단을 통한 clone 확인...32
• 제 5 장 연구성적...33
• 제 1 절 Insert 준비...33
• 제 2 절 Expression vector 준비...34
• 제 3 절 Transformation...34
• 제 6 장 고 찰...51
• 제 7 장 참고문헌...53