초록 ▼

여러속의 세균을 대상으로 O(sup)(-)(sub)(2)을 특이적으로 제거시켜 주는 Superoxide dismutase(SOD)의 활성을 검토해 본 결과 Gram 양성군으로서 산업적 및 의학적 가치가 높다고 인정된 Bacillus circulans 가 비교적 높은 활성을 나타냈으므로 이를 본 실험의 공시균주로 선택한 다음 SOD의 최적 생산 조건을 설정하고 정제하여 정제효소의 효소화학적 성질을 밝혔다.
1. SOD의 생산은 각 세균에 따라서 양적인 차이는 있으나 종, 속에 관계없이 다양하게 존재하였다.
2. SOD생성의

여러속의 세균을 대상으로 O(sup)(-)(sub)(2)을 특이적으로 제거시켜 주는 Superoxide dismutase(SOD)의 활성을 검토해 본 결과 Gram 양성군으로서 산업적 및 의학적 가치가 높다고 인정된 Bacillus circulans 가 비교적 높은 활성을 나타냈으므로 이를 본 실험의 공시균주로 선택한 다음 SOD의 최적 생산 조건을 설정하고 정제하여 정제효소의 효소화학적 성질을 밝혔다.
1. SOD의 생산은 각 세균에 따라서 양적인 차이는 있으나 종, 속에 관계없이 다양하게 존재하였다.
2. SOD생성의 최적 배지 조성은 Dextrose 1%, Polypeptone 2%, NaCl 0.1% 이었고 최적 pH는 6.0 이었으며 500 ㎖ 용 진탕플라스크에 배지 100㎖ 을 넣어 30℃ 20 시간 배양 했을때 SOD가 최대로 생산되었다.
3. 조효소액은, pH가 5.0 이고 안정제로서 5% Ethyl alcohol을 함유한 Acetate buffer에서 안정한 것으로 나타났다.
4. SOD는 다음과 같은 절차에 의해 정제되었다. 즉 조효소액을 30-80% 유안분획, 1차 DEAE-Sephadex A-50 column chromatography, 다시 유안 80% 포화에 의한 불순 단백질 제거, 2차 DEAE-Sephadex ion exchange chromatography, Gel filtration on Sephadex G-100 등의 조작에 의해 Disc전기영동상 단일한 효소단백질로까지 정제하였다.
5. 정제효소의 자외선 영역에서의 흡광은 전형적인 protein pattern 으로 나타났으며 280 nm 에서의 E(sup)(1%)(sub)(1 ㎝)은 14.9였다. 280 nm 외에도 475 nm 에서 최대흡광치를 나타낸다는 사실과 농축효소가 red-purple 색을 띠는 것으로 보아 본 효소는 Mn 을 함유한 Mn-SOD 임을 시사하였다.
6. 정제효소의 분자량은 Gel filtration에 의해 약 46,000 으로 판단되었으며 subunit의 분자량은 2-mercaptoethanol으로 전처리한 후 SOD disc 전기영동한 결과 26,000 으로 판단되었다.
7. 정제효소의 등전점은 Polyacrylamide gel isoelectric focusing에 의해 5.2 인 것으로 결정되었다.
8. 정제효소는 pH7.0, 20℃에서 36시간 동안 안정하였으나 9.0 이상과 5.0 이하는 급격히 실활하였다. pH7.0인 정제효소의 온도 안정성은 35℃에서 20분 동안 안정하였다.
9. SOD의 활성을 촉진하는 금속이온은 없었으나 0.1 mM의 An?? 와 Cu?? 은 부분적으로 저해하였으며 1.0 mM의 Cu?? 은 완전히 저해하였다. 일반적인 효소저해제로 이용되는 MIA와 P-CMB는 효소활성을 저해하지 않고 오히려 약간 증가시키는 경향을 나타냈으며 CN?가 효소활성에 아무런 영향을 미치지 않는 것으로 보아 본 효소는 Fe-SOD 일 가능성도 있으나 이것은 매우 미량으로 존재하므로 역시 Mn-SOD일 가능성도 높여 주었다.

Abstract ▼

Distribution of superoxide dismutase(SOD) was studied in various genera of bacteria. Bacillus circulans which produced relatively large amount of SOD was selected and used to investigate the optimum cultural condition and purified to examine the various properties of the SOD.
Superoxide dismutase

Distribution of superoxide dismutase(SOD) was studied in various genera of bacteria. Bacillus circulans which produced relatively large amount of SOD was selected and used to investigate the optimum cultural condition and purified to examine the various properties of the SOD.
Superoxide dismutase was produced by various bacteria independent of genus and species with variation in amount of each bacteria. The composition of optimum culture medium for the enzyme production was Dextrose 1%, Polypeptone 2%, NaCl 0.1% and 0.2 mM of Methyl viologen and the initial pH was 6.0. The cultivation for the enzyme production was carried out in 500 ml shaking flask containing 100ml of the optimum medium at 30? on a reciprocal shaker. The highest enzyme production was observed after 20 hours of cultivation. The crude enzyme was stable in pH 5.0, 0.01 M acetate buffer containing 5% ethyl alcohol as stabilizer. SOD was purified by the following procedures; ammonium sulfate fractionation, two times of colum chromatograpy on DEAE-Sephadex A-50, concentration by immersible ultrafilter CX-10 and gel filtration on Sephadex G-100. This purified enzyme was homogeneous on disc gel electrophoresis and densitometric tracing. The absorption pattern in ultraviolet was typical of that seen with most proteins and El?(sup)(%)?(sub)(cm) at 280nm was 14.9. The visible absorption spectrum with maximum wavelength 475nm and the red purple color of the concentrated enzyme suggested presence of Mn in SOD. The molecular weight of the purified enzyme was estimated to be about 46,000 by gel filtration. The purified enzyme was subjected to sodium dodecyl sulfate disc gel elecprophoresis in the presence of 2-mercaptoethanol and yielded a subunit molecular weight of 26,000. The isoelectricpoint of the enzyme was determined to be 5.2 by polyacrylamide gel isoelectric focusing. The purified enzyme was the most stable at pH 7.0, 20?, for 36 hours, but rapidly inactivated above pH 8.0 and below pH 5.0. SOD was stable at pH 7.0 below 35? for 20 minutes of incubation. There was no metal ion which promoted the SOD activity. Zn??and Cu??of 0.1mM partialy inhibited but 1.0mM of Cu?? completely inhibited the SOD activity. MIA and p-CMB, commonly used as an inhibitor, increased the activity a little rather than inhibited. That the cyanide ion had no effect on the enzyme activity was also suggestive of Mn-SOD.

목차 Contents

• I. 서론...9
• II. 시료 및 실험 방법...14
• 1. Superoxide dismutase 생성균주의 검색...14
• 2. SOD 활성측정법...15
• 3. 균의 생육도 측정...15
• 4. 단백질의 정량...16
• 5. 배양과 조효소액의 조제...16
• 6. 분자량 및 subunit molecular weight 측정...16
• 7. 등전점 측정...17
• 8. 정제 단백질의 아미노산 분석...17
• 9. 사용 시약 및 기기...17
• III. 실험 결과 및 고찰...19
• 1. SOD 생성균주의 검색...19
• 2. SOD 생성조건 및 안정화 조건 검토...21
• 1) 탄소원의 영향...21
• 2) 질소원의 영향...21
• 3) 무기염의 영향...23
• 4) 초발 pH의 영향...23
• 5) 통기량의 영향...27
• 6) Methyl viologen(paraquat)의 효과...27
• 7) 배양시간의 경과에 따른 균의 증식 및 효소의 생성...29
• 8) 안정제의 검토...29
• 9) 조효소액의 pH 안정성...31
• 3. 세포내 SOD의 정제...31
• 1) 황산암모늄 분획...35
• 2) 1차 DEAE-Sephadex A-50 column chromatography...35
• 3) 2차 DEAE-Sephadex A-50 column chromatography...36
• 4) Sephadex G-100 column chromatography...39
• 5) Disc gel 전기영동 및 Densitometer tracing 에 의한 정제 효소의 검정...42
• 4. 정제 효소의 물리화학적 및 효소화학적 성질...42
• 1) 자외선 및 가시광선의 흡수 spectra...45
• 2) E$^{1\%}_{1cm}$ at 280 nm...45
• 3) 분자량 및 subunit molecular weight...47
• 4) 등전점...49
• 5) 온도 안정성...50
• 참고 문헌...57