초록 ▼

I. 성장단계별 단백질 분해효소의 정제 및 특성
폐흡충(Paragonimus westermani) 피낭유충을 개에 인공감염시켜 피낭유충군, 1개월군, 2개월군 및 3개월군(성충)으로 구분하고 조효소를 추출한 후 AcA54 및 AcA34 gel filtration column chromatogrphy를 실시한 다음 합성 dipeptide 기질인 carboxybenzoyl-phenyla lanyl-arginine-7-amion-4-trifluoromethylcoumarian(CBZ-phe-arg-AFC)을 사용하여 성장단

I. 성장단계별 단백질 분해효소의 정제 및 특성
폐흡충(Paragonimus westermani) 피낭유충을 개에 인공감염시켜 피낭유충군, 1개월군, 2개월군 및 3개월군(성충)으로 구분하고 조효소를 추출한 후 AcA54 및 AcA34 gel filtration column chromatogrphy를 실시한 다음 합성 dipeptide 기질인 carboxybenzoyl-phenyla lanyl-arginine-7-amion-4-trifluoromethylcoumarian(CBZ-phe-arg-AFC)을 사용하여 성장단계별로 cysteinyl proteinase를 부분정제한 후 이들 효소의 활성도 및 특성이 어떻게 변화하는가를 관찰하였다.
각 실험군에서 추출한 조효소를 0.1M sodium citrate buffer(pH 5.5)로 평형된 AcA54 ultrogel에 통과시켜 얻은 활성양상을 관찰한 바 모든 실험군에서 2개의 peak(PI과 PII)가 나타났는데, 이 효소들의 분자량을 산정한 결과 효소 PI은 약 150,000이였고, PII는 약 20,000이였다.
부분정제된 효소의 적정 mole농도는 0.1M이였고, 적정 pH는 5.5로 이들 모든군의 효소는 acidic proteinase였다.
부분정제된 효소(PI과 PII)의 비활성도(specific activity)를 이들 각 군별로 비교 관찰한 결과 모든 군의 효소 PI이 PII보다 높은 비활성도를 보았다. 또 피낭유충군과 1개월군의 효소(PI과 PII)가 2개월군과 3개월군보다 높은 비활성도를 보여 이들 효소는 성충보다 미성숙한 충체에서 비활성도가 높은 것으로 나타났다.
효소(PI과 PII)가 iodoacetic acid, MEM 및 E-64에 대해서는 모두 활성이 억제되었으나 PMSF와 DEP에서는 효소 PII의 활성은 억제되지 않았으나 PI은 모두 억제되어 이들 효소가 cysteinyl proteinase 라 생각되나 효소 PI보다는 PII가 더 순수한 cysteinyl propeinase 라 생각된다.
가군 PI 효소의 활성은 leupeptin에 의해 완전히 억제되었으나 PII의 경우는 피낭유충군에는 가장 높은 활성을 보이다가 충체의 성장에 따라 점진적으로 낮아져서 3개월군(성충)에서는 완전히 억제됨을 보였다.
Chelating agent에 대한 PI 효소의 활성은 억제되었으나 PII은 영향을 받지 않았다. 그리고 Heavy metal에 대한 효소(PI과 PII)의 활성은 모두 억제되었다.
효소(PI과 PII)가 azocoll을 분해하는가를 관찰한 결과는 모든 군의 PII 효소가 I보다 분해능력이 높게 나타났고 피낭유충군의 결우는 두 효소(PI과 PII)가 다른 군의 효소보다 높은 분해능력을 보였다.
II. 성충의 단백질 분해효소 전정제 및 특성
폐흡충(Paragonimus Westermani) 피낭유충을 개에 인공감염시켜 3개월 사육한 후 도살하여 개의 폐에서 충체를 수집하였다.
이들 성충에서 추출한 조효소는 Ion-exchange chromatogrphy(CII-Trisacryl M과 DEAE-Trisacryl M)와 AcA54 gel filtration column chromatogrpahy를 사용하여 정제한 다음 이들 성충에 내포되어 있는 cysteinyl proteinase의 활성도 및 특성을 관찰하였다.
성충에서 추출한 조효소(0.1M sodium citrate buffer, pH 5.5)에 dipeptide 합성 기질인 CBZ-phe-arg-AFC와 CBZ-arg-arg-AFC을 사용하여 활성도를 측정한 결과 후자보다 전자가 더 높은 활성을 보였다.
그리고 이들 효소에 cysteinyl proteinase의 활성계인 DTT를 첨가하였을 때보다 더 강력한 활성도를 보여 이들 충계는 acidic thiol cysteinyl proteniase가 많이 내포되었 peak(PI과 PII)가 나타났는데 PI과 PII의 분자량이 모두 약 20,000으로 나타났다.
효소(PI과 PII)의 비활성도(specific activity) 는 PI보다 PII가 높은 비활성도를 보였고, 이들의 정제도는 조효소보다 PI은 약 83배, PII는 127배로 정제되었다. 그리고 이들의 정제도를 전기영동상으로 관찰한 결과는 정제과정을 거치는 동안 시료가 더 순수하게 정제됨을 확인할 수 있었다.
두 효소(PI과 PII)는 iodoacetic acid, NEM, E-64, leupetin, TPCK 등에 대해 모두 활성이 억제되었으나 TRAK, pepstatin, PMSF 및 DFP에 대해서는 활성이 억제되지 않아 이들 효소(PI과 PII)가 cysteinyl proteinase 임을 확인할 수 있었다.
또 이들 효소(PI과 PII)가 azocoll을 분해하는가를 관찰한 결과는 모두 분해능력을 가지고 있었다. 그리고 PI보다는 PII가 높은 분해능력을 보였고 이들에 DTT를 첨가하였을 때 효소의 활성이 더 강력하였다.
정제된 효소들이 azocoll 분해에 미치는 영향을 관찰한 결과는 이들 반응액에 DTT를 첨가하여 반응시켰을 때 효소 I보다 효소 II가 높은 분해능력을 보였고, DTT를 첨가하지 않고 반응시켰을 때 효소 I과 II 모두 큰 분해능력을 보이지 않았다.
정제된 효소들이 hemoglobin을 분해하는가를 관찰한 결과는 이들 효소들은 모두 높은 분해능력을 보였다. 또 이들을 반응시간별로 15% SDS-PAGE에 영동하여 그들의 영동상을 관찰한 결과는 정제된 효소(I과 II)를 첨가한 것은 hemoglobin의 dimar band와 monomer band가 반응시간에 따라 이들 band가 희미하게 나타나 이들 효소는 hemoglobin을 분해할 수 있다고 생각된다.
정제된 효소들이 collagenoylsis을 할 수 있는 가를 관찰한 결과는 collagen의 beta-chain 및 alpha?-chain이 정제된 효소에 의해 분해되어 희미하게 나타나고 새로운 3개의 band(product I, II 및 III)가 영동상에 나타났으며, 이들의 분자량을 산정한 바 product I은 69,000이고, II는 66,000이었으며 product III은 51,000이었다.
정제단계의 효소들에 둥전점(isoelectric point)을 관찰한 결과는 최종 정제단계 과정을 거친 효소 I의 둥전점은 4.65이었고 효소 II은 4.70이었다.
III. 정제된 효소의 항원성 관찰
폐흡충 성충으로 부터 추출한 조효소를 각 정제단계 과정을 거치며 이들의 항원성 유무와 최종 정제된 효소 I과 II의 항원성을 관찰하기 위해 Immuno-diffusion과 western transfer bolt를 실시하였다.

Abstract ▼

The metacercaria of Paragonimus westermani can infect the lung of their hosts by ingestion of raw or insufficiently cooked crabs or crayfish. In their hosts, most of the damage caused by the lung fluke results from larva migrations.
In the lung there is the same type of destruetive lesions with

The metacercaria of Paragonimus westermani can infect the lung of their hosts by ingestion of raw or insufficiently cooked crabs or crayfish. In their hosts, most of the damage caused by the lung fluke results from larva migrations.
In the lung there is the same type of destruetive lesions with the formation of cysts and abscesses.
1. Partial purification and characterization in various developmental stages of P. westermani.
In this report, homogenates of the developmental stages of these worms were prepared and their proteolytie enzyme was examined.
Homogenates were prepared in 0.lM sodium citrate pH 4.9 contained multiple proteolytic enzyrnes that had aetivity againt both azocoll and synthetic substrates(carboxybenzoyl-phenylalanine-argin- ine-amino-4-trifluoromethylcoumarin carboxybenzoyl-arginine-arginine- 7-amino-4-trifluoromethyl coumarin ).
Cysteinyl proteinase from the stages of metaeerearia, 1 month, 2 months and 3 months of the lung fluke were isolated 2 major proteinases(I & II) were purified to homogenaty using AcA54 and AcA34 gel filtration column chromatography.
Proteinase I and II have molecular weights of about 150,000 and 20,000 daltons, respectively.
These proteinases(I & II) require thiol for activity and have an acidic pH optimum.
These proteinases I have not serine proteinases site-specific inhibitor(PMSF andDFP) susceptibilities but in case of proteinase is has.
And these proteinase(I & II) have not cysteinyl proteinase
The CBZ-phe-arg-AFC was used for these studies, because it had higher activity than CBZ-arg-arg-AFC.
Cysteinyl proteinases from adult of the lung fluke worms were isolated, 2 major proteinases(I & II) were purified to homogeneity using ion-exchange chromatography(CM-Trisacryl M and DEAE-Trisacryl M) and AcA54 gel filtration column ehromatography.
Proteinase I and II have molecular weights of about 20,000 daltons, respeetively.
Proteinase I and II purified with AcA54 ultrogel have about 83 and 127 times purifieation fold, respectively, to the crude extracts. This results were confirmed from 12.5% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis by silver staining.
Also, proteinase I and II was appeared to the molecular weigh of ahout 16,000 daltons and 14,000 daltons, respectively, by l2.5% SDS-polyaerylamide gel electrophoresis.
These proteinases(I & II) require thiols for activity and have an acidic pH optimum
And these proteinases have not serine proteinase site-specific inhibitor(PMSF and DFP) susceptibilities but cysteinyl proteinase site-specific inhibitor(iodoacetic acid, NEM and E-64) susceptibilities similar to the vertebrate acidic thiol cysteinyl proteinase.
These proteinase(I & II) are inhibited by both chelating agents (1,10-phenanthroline and EDAT) and heavy metal(HgCl2).
Studies on hemoglobin and azocoll specificity showed that these proteinases are hydrolyzed and proteinases II have higher activity than that of proteinase I with dithiotheitol(DTT).
"Hemoglobinase" activity was tested fort the ability to degrade hemoglobin(Hb) in vitro in the presence or the absence of proteinases(I & II).
In this results, the presence of proteinases(I & II) showed inhibitor(iodoacetic acid, NEM and E-64) susceptibilitis similar to vertebrate acidic thiol eysteinyl proteinase.
However, the activity of proteinase I showed inhibition perfectyl against leupeptin(general cysteinyl and serine proteinase inhibitor agent) but the activity of proteinase II was gradually intense inhibited by it with the growth of lung fluke worms.
In these proteinase(I & II ) against the chelating agents and heavy metals, they are not inhibited by EDTA but only proteinase I is inhibited by 1,10-phenanthroline. And they are inhihited by heavy metal (HgCl2 )
In these proteinase purified from developmental stages worm, proteinase I have higher specific activity than that of proteinase II and these proteinases purified from the stages of metacercariae and 1 month showed more intense speeific activity than those of 2 months and 3 months worm.
Studies on azocoll speeifieity showed that the proteinase II is more hydrolyzed than proteinase I, and these proteinase of metacercaria showed higher activity than those of 1 month, 2 months and 3 months worm. II. Purification and characterization in adult worm of P. westermani
In this report, the homogenates of adult worm inoculated during 3 months in the dogs were prepared and their proteolytic enzyme was examined.
Homogenates were prepared in 0.1M sodium citrate, pH 4.9 contained multiple proteolytic enzymes that had activity against hemoglobin, azocoll and synthetic substrates(carboxybenzoyl-phenylalanine-arginine-7-amino-4-trifluoromethylcoumarin, carboxybenzoyl-arginine-arginine-7-aminp-4-trifluoromethylcoumarin). lower activity th n that of the absence with 5mM DTT by the spectrophotometer(595nm).
In 15% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of hemoglobin, All lane showed two band of the hemoglobin monomer(A band; Mw. 30,000 daltons, B band; Mw. 14,300 daltons). Degradation of Hb is seen with a significant decrease in the Hb monomer band with proteinase(I & II) at 6hrs .
Collagenolytic activity was tested for the ability to degrade collagen in vitro in the presence or the absence of proteinases(I & II ) .
In this results, these proteinase I and Il showed acidic collagenolytic activity as indicated by the disappearance of the collagen and alpha-chains and the appearance of three new bands(product I, II and IIl)(Fig. 16).
As is shown in Fig. 17, the three new protein bands obtained after digestion with the proteinase I and II were designated product I, II and III, and had approximately molecular weights of 69,000, 66,000 and 51,000 daltons, respectively .
The isoelectric point of proteinase I and II purified from P. westermani adult worms were 4.65 and 4.70, respectively.
III. Immunological assays of partially purified proteinases .
In order to observe if the purified proteinases from P.wester- mani adult worms have immunogcnicity, sera from infected human (paragonimiasis) were examined by immuno-diffusion using purified steps enzymes.
As is shown in Fig. 19, precipitin lines are shown to all proteinases of purified steps.
A anti-serum of human(paragonimiasi), speci?c to purified proteinases(I and Il ) of P. westermani adult worms was used in immulloimmunoblotting studies.

목차 Contents

• 폐흡층(Paragonimus westermani)의 성장단계별에 따른 cysteniyl protenase의 활성도...1
• 표지...1
• 1. 서론...15
• 2. 재료 및 방법...18
• 2.2. 시약 및 재료...18
• 2.2. 실험방법...19
• 3.1. 결과...31
• 3.1. 성장단계별 단백질 분해효소의 정제 및 특성...31
• 3.2 성충의 단백질 분해효소 정제 및 특성...52
• 3.3. 정제된 효소의 항원성 관찰...72
• 4. 참고문헌...76