보고서 정보
주관연구기관 |
이화여자대학교 Ewha Womans University |
연구책임자 |
이강만
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참여연구자 |
신윤용
,
배무
,
이상섭
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발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 1992-09 |
주관부처 |
과학기술부 |
사업 관리 기관 |
이화여자대학교 Ewha Womans University |
등록번호 |
TRKO200200013130 |
DB 구축일자 |
2013-04-18
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키워드 |
delta-I-dehydrogenase.9α-hydroxylase.aromatase cyt.P450.sterol side chain cleavage.steroid hormone.delta-I-dehydrogenase.9α-hydroxylase.aromatase cyt.P450.sterol side chain cleavage.steroid hormone.
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초록
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본연구에서는 내분비 조절을 통한 인체 생리 기능과 산업적으로 스테로이드 의약품 생산에 중요한 스테롤의 측쇄분해, 모핵분해 및 방향화 반응에 관여하는 효소들에 대하여 그들의 특성과 작용기전을 연구하였다.
스테롤 측쇄분해에 관한 과제에서 Mycobacter ium sp. NRRL B-3805 균주의 세포 추출액에 존재하여 lithocholic acid 와 5β-cholanic acid-3-one 의 측쇄를 분해하여 5β-androstan-3, 17-dione 을 생성하는 활성을 확인하였으며 (NH?)?SO? 분별침전과 DEAE-
본연구에서는 내분비 조절을 통한 인체 생리 기능과 산업적으로 스테로이드 의약품 생산에 중요한 스테롤의 측쇄분해, 모핵분해 및 방향화 반응에 관여하는 효소들에 대하여 그들의 특성과 작용기전을 연구하였다.
스테롤 측쇄분해에 관한 과제에서 Mycobacter ium sp. NRRL B-3805 균주의 세포 추출액에 존재하여 lithocholic acid 와 5β-cholanic acid-3-one 의 측쇄를 분해하여 5β-androstan-3, 17-dione 을 생성하는 활성을 확인하였으며 (NH?)?SO? 분별침전과 DEAE-Sepharose column을 통하여 부분정제하였다. 유용한 규주를 얻기 위한 선별과 변이 실험에서 한국 토양으로 부터 스테롤 분해력과 α,α'-dipyridyl 존재하에서 콜레스테롤을 1,4-androstadiene-3,17-dione으로 20%내외의 수율로 전환하는 한 균주를 분리 동정하였다. Mycobacterium sp. NRRL B-3683 균주의 변이 실험과제에서 testosterone을 주로 생성하는 변이주를 얻었다.
스테로이드 A환의 방향화 효소의 cDNA 클로닝에 관한 과제에서는 사람의 태반으로 부터 aromatase cytochrome P450 단백질을 phenyl-sepharose, Bio-beads SM-2, DEAE column을 통하여 분리하고 SDS-PAGE에서 분자량이 55,000에 해당하는 단백질을 취하여 Balb/C 생쥐에서 항체를 얻어 cDNA 선별에 probe로 사용하였다. cDNA 클로닝은 mRNA를 사람태반으로 부터 분리하고 역전사 효소와 Klenow 효소를 이용 ds cDNA를 만들고 lambda gtll에 연결. E. coli Y1090 에다 cDNA library를 만들었다. 이 library를 선별하여 양성클론을 얻고, cDNA를 bluescript vector에 subcloning 하여 exonuclease Ⅲ 처리에 의한 deletion 클론들을 얻어 DNA sequencing을 실시하였다. 얻어진 DNA sequence는 503 의 아미노산으로 구성된 단백질을 코딩하였으며, cysteine이 20개 들어 있는 sytochrome P450 의 특성을 지니고, pSVL vector에 연결된 cDNA는 Cos-1 세포에서 방향화효소 활성을 나타내었다.
스테로이드 delta-1-dehydrogenase 효소에 관한 과제에서는 Arthrobacter simplex IAM 1660 균주를 대상으로 효소의 유도 기작, 저해제, 유도효과등을 검토하여 유도물질로 hydrocortisone을 결정하였고, 유도된 효소의 기질특이성을 조사하여 3-ketosteroid 에 선택성이 있음을 확인하였다. 효소 단백질을 분리하기 위하여 세포 추출액을 streptomycin sulfate;(NH?)?SO? 분별침전, DEAE, phenyl-sepharose, testosteroneagarose column을 통하여 정제하였으며, 정제된 단백질은 분자량이 98,000 이었다. 효소반응에 Cu??, Fe??, Hg??, Mo??, EGTA등이 저해효과를 보였다. 분리된 단백질을 토끼에 주사하여 항체를 얻고 이를 A. simplex 균주의 염색체 DNA 조각을 lambda gt 11 vector에 연결하여 형성된 library를 선별하는데 이용하여 수개의 양성 클론을 얻었다.
스테로이드성 9α-hydroxylase 효소계에 관한 과제 실험에는 Mycobacterium fortuitum 세포 추출액에 활성이 있음을 확인하였으며, 활성은 O-pyenanthroline에 의하여 저해되며, sodium dithionite로 환원시켜 CO gas로 노출시켰을 때 450 nm에서 흡수를 보여 cytochrome P450의 관여를 시사하였다. 효소의 구성요소를 DEAE-cellulose column chromatography(1차, 2차)를 통하여 세가지 peak를 얻어 이들이 활성에 관여하고 NAD(P)H-의존성 flavoprotein reductase, protein Ⅱ, protein Ⅲ 임을 흡수 spectrum 을 통하여 확인하고, 재구성하여 활성이 나타남을 보였다. 우수균쥬를 얻기 위한 변이 실험에서 9α-OH-adrostene-3,17-dione을 축적하는 M-19 변이주를 얻었다. 유전자 클로닝을 위한 시도에서 유전자가 plasmid에 존재하지 않고, 염색체 DNA에 존재함을 실험하였으며, 염색체 DNA 조각을 pUC19 vector에 연결하여 선별하였는데 9α-hyroxylase 활성을 가진 클론은 얻지 못하고 17β-hydroxysteroid dehydrogenase 활성을 가진 클론을 선별하였다. 9α-hydroxylase 효소계가 Cyt. P450 의 특성을 가짐에 따른 효소계에서 공통적으로 나타나는 염기서열을 바탕으로 oligonucleotide probe를 만들어 재조합 유전자를 선별하는 실험도 실시하여 양성으로 나오는 클론을 얻었다.
Abstract
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Steroidogenic enzymes are important for the regulation of endocrine function in the body, and also necessary for pharmaceutical processes of steroidal hormone medicine. In this study. four enzyme systems such as steroid delta-1-dehydrogenase, 9α-hydroxylase which acts on the opening of B ring, stero
Steroidogenic enzymes are important for the regulation of endocrine function in the body, and also necessary for pharmaceutical processes of steroidal hormone medicine. In this study. four enzyme systems such as steroid delta-1-dehydrogenase, 9α-hydroxylase which acts on the opening of B ring, steroid aromatase (cytochrome P450) which converts androgen to estrogen, and sterol side chain cleavage enzyme that produce 17-ketosteroid were examined in order to understand the mechanism of action and characteristics of these steroidogenic enzymes via biochemical and molecular biological studies. First the sterol side chain cleacage enzyme study, it has been observed that the conversion of both lithocholic acid and 5β-cholanic acid-3-one to 5β-androstan-3, 17-dione was identified in Mycobacterium sp. NRRL B-3805, and the partial purification of this enzyme was carried out by (NH?)?SO? differential precipitation and DEAE-sepharose column chromatography. From the Korean soil, one strain of microoragnism that has side chain cleavage activity and accumulate 1, 4-androstadiene-3, 17-dione from cholesterol in the presence of α,α'-dipyridyl. And a mutant of Mycobacterium sp. NRRL B-3683 which produces testosterone was identified. Second, the human placenta aromatase was purified by phenyl-sepharose, Bio beaed SM-2, DEAE column chromatography, and ∼55,000 dalton protein was detected on SDS-PAGE. The protein was isolated form SDS-PAGE and used as antigen for the production of antibody which was used as a probe to screen cDNA library. From the positive clone of the tertiary screening of cDNA library, cDNA insert DNA was isolated and sequenced by double strand DNA sequencing with ??S-DATP. The alalysis of cDNA sequence showed a open reading frame of 1509 bps which corresponds to the sequence of 503 amino acids. The expression of the cDNA in Cos-1 cell showed the aromatase activity which indicates that cytochrome P450 XIX cDNA form human placenta was cloned. Third, the mechanism of induction and inhibition of delta-1-dehydrogenase was examined in Arthrobacter simplex IAM 1660 and it was observed that hydrocortisone was a inducer of this enzyme and the substrate for the induced enzyme is 3-ketosteroid. The purification of delta-1-dehydrogenase was conducted via (NH?)?SO? differential precipitation, DEAE, phenlyl-sepharose, testosteroneagarose column chromatography and 98,000 dalton protein was idetified on SDS-PAGE. The production of antibody against this purified protein is undertaken. Cu??, Fe??, Hg??, Mo??, EGTA are appears to be inhibitors of this enzyme. Genomic DNA was isolated frome A. simplex and was cloned into lambda gt11 vector and few positive clones were identified via library screening. Lase, 9-hydroxylase activity was identified form the cell extract of Mycobacterium fortuitum and this enzymatic activity was inhibited by 0-phenanthroline. The reducted enzyme with sodium dithionite showed 450nm absorption via CO complex, which suggests that this enzyme being a cytochrome P450. Three peaks of DEAE column cyromatographshowed 9α-hydroxylase activity, and based on spectrum those are NAD(P)H-dependent flavoprotein, Protein Ⅱ, Protein Ⅲ. When these proteins were reconstitued, the enzymatic activiy was recovered. M-19 mutant which accumulates 9α-OH-androstene-3, 17-dione was obtained. When genomic cloning was carried out, the clone has 17β-hydroxysteroid dehyrogenase activity instead of 9 α-hydroxylase activity. Using oligonucleotide of common sequence of cytodrome P 450 as a probe, a few postive clone were obatained.
목차 Contents
- 제 1 세 부 과 제...45
- 제 2 세 부 목 차...147
- 제 3 세 부 목 차...245
- 제 4 세부목차...335
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