초록 ▼

제 1세부과제:"유지관련제룸의 생산을 위한 미수계 효소반응기의 개발"
유기용매상에서의 가수분해반응에는 다음과 같은 연구를 수해하였다. Candida rugosa 로 부터 유래한 리파제를 몇가지 고정화 담체로 고정화하여, 이소옥탄에서 올리브유의 연속적 가수분해를 수행하는데 있어서 DEAE-sEphadex로 고정화한 경우가 부풀린 후, 유리반응기에 충진하였다. 기질인 올리브유를 포함하는 이소옥탄을 수용성 buffer와 동시에 공급하였을 때, 이상계는 유화제나 혼합과정없이도 충진반응 기내에 균일하게 분산되었다.

제 1세부과제:"유지관련제룸의 생산을 위한 미수계 효소반응기의 개발"
유기용매상에서의 가수분해반응에는 다음과 같은 연구를 수해하였다. Candida rugosa 로 부터 유래한 리파제를 몇가지 고정화 담체로 고정화하여, 이소옥탄에서 올리브유의 연속적 가수분해를 수행하는데 있어서 DEAE-sEphadex로 고정화한 경우가 부풀린 후, 유리반응기에 충진하였다. 기질인 올리브유를 포함하는 이소옥탄을 수용성 buffer와 동시에 공급하였을 때, 이상계는 유화제나 혼합과정없이도 충진반응 기내에 균일하게 분산되었다. 충진 단계에서만 소량의 유화제 (AOT)를 사용하였고, 그 이후에는 추가의 유화제를 첨가하지 않았다. 또한 젤을 부풀리는 단계에서의 초기 수분함량, buffer의 종류, 이온 세기등의 영향을 연속반응에서 조사하였다. 운전반감기는 결합된 단백질의 해리정도에 의해 크게 영향을 받았고, 어떤 유화제나 전단계의 혼합과정없이도 다양한 효소 담체가 충진식 반응기에서 이상계 연속반응을 수행하는데 사용될 수 있음을 보여 주었다. 고정화 리파제의 안정성을 높은 기질농도에서 크게 증가되었고, 20％ 올리브유와 25 mM triethanolamine buffer에서 운전 반감기는 30℃에서 220시간이었다. 또한 수용액계에 첨가된 글리세롤은 유기용매에 대한 안정화에 도움을 주어 15％글리세롤에 의해 220시간의 반감기가 450시간으로 증가되었다. 반응기는 유기용매가 핵산인 경우에도 운전 가능하였지만 이 경우는 운전 반감기가 이소옥탄의 경우에 비해 절반 정도였다. 이상계에서 생균을 이용한 올리브유의 가수분해반응에서는 내유기용매성 균주로서 Pseudomonas putida 3SK를 리파제원으로 사용하였다. 이 균주는 이상계에서도 잘 자랐고 동시에 리파제를 생산함으로서 효과적인 가수분해반응을 수행할 수 있었다. 조사한 유기용매들중 이 소옥탄의 본 연구목적에 가장 적합하였고, 올리브유 뿐만 아니라 가수분해에도 이 반응계가 적합한 것으로 나타났다.
리파제를 이용한 중쇄글리세리드의 합성 반응은 유기용매나 유화제없이, 기질인 capric acid와 글리세롤을 사용하여 고정화 리파제인 Lipozyme(sup)(TM)으로 반응을 수해하였다. 반응산물의 정량분석을 위해 HPLC를 사용하여 capric글리세리드의 합성을 에스테르화 반응 활성을 40℃ 온도에서 회분석 반응기에서 결정하였을때, capric 글리세리드와 oleic 글리세리드 합성에 대한 활성은 각각 그림당 400 과 200 units였다. 최대의 초기 반응속도를 나타내는 온도는 capric 그리세리드 합성의 경우는 50℃에서, oleic 글리세리드의 경우에는 60℃였다. Capric 글리세리드 합성의 시간 경로를 몰비율의 관점에서 비교하였다. 최종전환율은 수분을 제거하는 방법에 의해 크게 영향을 받았고, 냉각장치를 연결하였을때 전환율이 크게 증가하였다.
에스테르 교환반응을 연구하기 위해서 triolein과 strearic acid을 기질로 사용하여 우선 8가지 상업적 리파제에 대해 본 반응의 가능성을 조사하였다. 세가지 곰팡이 유래의 리파제가 적합한 것으로 나타났다. 그리고 리파제의 가수분해 활성과 에스테르교환 반응 활성간에는 어떤 상관관계가 없는 것으로 나타났다. 조사된 리파제들중 Mucor miehei 유래의 리파제가 단백질 함량과 가수분해 및 교환반응 활성이 높아 이 리파제를 차후의 실험에 사용하였다. 교환반응에서의 수분함량의 영향을 조사해 보았을 때 수분활성도 0.25에서 최대의 교환반응 활성을 보였고 수분활성도가 증가함에 따라 트리글리세리드이 가수분해가 촉진되었다. 수분활성도 0 에서 , 교환반응 활성은 0.25의 경우보다 낮은 반면 전환율은 높았다. 리파제에 소수성을 부여하고, 에스테르 교환활성을 높이기 위한 새롭고 간단한 고정화 방법을 개발하였다. 리파제는 소수성 담체인 Florisil (마그네슘 실리케이트, 무기질 담체)에 글루타알데히드로 직접 혹은용하였을 경우 원래의 활성보다 88배 증가하였다. 이를 이용한 충진형 연속반응기에서 반감기는 약 97일로 나타났다.
리포좀에 고정화된 chromobacterium viscosum 리파제를 소량의 물을 함유한 그리세롤 방울로 이루어진 마이크로 에멀젼에 녹여 올리브유의 글리세롤리시스 반응을 촉매할 수 있었다. 고정화 리파제의 에멀젼에 녹여 올리브유의 글리세롤리시스 반응을 촉매할 수 있었다. 고정화 리파제의 연속 글리세롤리시스 반응은 폴리술폰 막이 장치된 연속교반 진탕배양기에서 37℃로 수행하였다. 이소옥텐에 녹아있는 기질(올리브유)의 공급속도에 따른 반응생성물의 조성과 전환율은 HPLC로 확인하였다. 전환율은 유속이 감소할수록 증가하였다. 또한 글리세롤-물-리파제 용액중에 함유된 물의 양이 글리세롤리시스 반응의 전환율에 미치는 영향을 살펴본 결과, 원하는 산물인 모노- 및 디-올레인의 전환율은 낮은 물의 농도 즉 8.0％ (w/v) (Wo = 0.97)의 수분함량에서 부산물인 올레인산의 생성 없이 향상되었다. 수분함량 8.0％이상에서는 올레인산의 생성이 급격히 증가하였다. 본 고정화 리파제를 이용한 연속교반 진탕반응기에서의 운전 안정성은 아주 좋았으며 반감기가 7주로 나타났다.
pUC19의 BamHI 부위로 Pseudomonas fluorescens SIK W1유래의 염색체 절편을 삽입함으로서 열안정성 리파제에 대한 유전자를 대장균으로 클로닝하였다. 트리부트린을 포함하는 rhodamine-B가 포함된 한천배지에서 이차적으로 검색하였을 때 이들중 하나만이 리파제 활성을 보였다. 이 리파제 유전자의 완전한 염기서령을 밝혔다. 리파제 유전자는 1347 염기길이의 open reading frame이 찾아졌고 이것은 449 개의 아미노산 잔기를 encoding하는 것으로 나타났다. 이 리파제의 아미노산 배열을 다른 미생물에서 유래한 리파제 배열과 비교해 보았을 때 Gly-X-Ser-X-Gly의 homologous region이 찾아졌다. 클로닝된 리파제를 발현 벡터인 pTTY2를 사용하여 대장균에서 대량 발현하였을 때, 총 대장균 단백질의 40％에 해당하는 리파제가 만들어졌고, 이때 생성되는 리파제는 함유체의 형태로 발현되었다. 이 함유체를 8 M urea 에 의해 용해시킨 후 생물학적 활성을 가진 형태로 refolding 시킬 수 있었고, refolding 된 시료로부터 활성 리파제만을 분리정제할 수 있었다. 정제된 리파제의 최적 온도와 pH는 각각 40-45℃와 8.0-9.0이었다. 그리고 기질특이성을 포함하는 다른 효소적 특성들도 규명하였다.
제 2세부과제: "분쇄마찰매체함유 불균일상 효소반응계를 활용한 생전분의 고순도, 고농도 포도당으로의 전환과 HFCS 제조공정에의 응용"
본 연구는 분쇄마찰매개함유 불균일상 효소반응계를 활용한 생전분의 고순도, 고농도 포도당으로의 전환과 HFCS 제조공정에의 응용에 관한 연구로서 얻어진 성과를 요약하면 다음과 같다. 즉 분쇄마찰매체함수 효소반응계에서의 생전분의 효소 당화촉진 mechanism 을 전분입자의 구조적 측면에서 규명하였고, 고농도 고순도의 포도당과 맥아당 생산을 위한 최적 당화조건을 확립하였다. 또한 생전분의 무증자 효소당화 kinetic model을 수립하였으며, 고효율 bioreactor의 개발을 위한 기초적 자료를 확보하였다. 이를 바탕으로 생전분 무증자 당화법을 도입한 새로운 기술혁신적 high fructose corn syrup(HFCS)제조공정과 고순도 맥아당 제조공정을 도출하였으며, 도출된 신 공정의 산업적 응용을 위한 방안을 제시하였다. 그리고 본 공정의 산업화를 추진하기 위하여 산.학.연 협동연구를 계획하고 추진하고 있다.
기존의 HFCS 또는 맥아당 제조공정에서 활용하고 있는 전분의 증가 당화법은 전분증자, 고순도 당화, 당화액의 농축등에 많은 공정열이 소비되는 에너지 소모형 공정이며, 복잡한 분리정제과정이 요구되는 등 단점이 있다. 이를 개선하기 위하여 본 연구에서는 전분의 효소당화시 분쇄마찰매개를 첨가하여 전분입자를 구조적으로 변화시켜 당화상 효소반응계를 도입한 새로운 기술혁신적 HFCS 및 맥아당 제조공정을 개발하기 위하여, 기초적 연구를 수행함과 동시에 도출된 신 공정의 산업적 응용을 위한 방안을 제시하였다. 분쇄마찰매개함유 효소반응계란 전분질의 효소당화시 유리구와 같은 고형매체를 첨가하여 교반하므로써 증자하지 않고도 전분입자를 구조적으로 변형 시키면서 당화를 현저히 촉진시키는 고효율 생전분 무증자당화법이다. 본 반응계에서 생전분 효소당화촉진 현상은 분쇄마찰매체의 물리적 층격과 효소의 침식작용이 동시에 작용하여 생전분입자는 많은 작은 입자들로 단편화 되고, 효소 작용이 일어나는 가용표면적인 현저히 증가되어, 효소의 작용이 보다 용이하기 때문인 것으로 판단되었다. 또한 glucoamylase와 α-amylase의 상호보완작용에 의하여 생전분의 당화율은 크게 증가되었고 두 효소를 적절히 혼합함으로써 고순도의 포도당액을 얻을 수 있었다. (원문참조)

Abstract ▼

Subtitle 1 : "Development of Microaqeous Enzyme Bioreactor for Production of Fats and Oils Related Products"
Lipase from candida rugosa was immobilized with several gel matrix. The enzyme immobilized with DEAE-Sephadex A50 was found to be the most effective for continuous hydrolysis of oliv

Subtitle 1 : "Development of Microaqeous Enzyme Bioreactor for Production of Fats and Oils Related Products"
Lipase from candida rugosa was immobilized with several gel matrix. The enzyme immobilized with DEAE-Sephadex A50 was found to be the most effective for continuous hydrolysis of olive oil in isooctane. For the continuous reaction, 0.2 g of dry immobilized enzyme was swollen with perdetermined amount of water, and packed in a glass column reactor. When the organic solvent (isooctane) containing olive oil as a substrate was concurrently fed with aqueous buffer, the two phases were evenly distributed throughout the packed bed without surfactant supplement or prior mixing. A small amount of the surfactant (AOT) was used only in packing procedure, and no additional surfactant was necessary thereafter. Effects of initial water content of the swollen gel, buffer types, and ionic strengh were examined in the continuous reaction. Our results suggest that the opreational half-life was affected by desortion of the bound enzyme. Our results indicate that various enzyme carrier having hydrophilic or amphiphilic properties could be used for two-phase continuous reaction in packed-bed column reactor without any surfactant supply or prior dispersion of the two immiscible phases. Stability of the immobilized enzyme was greatly increased in higher substrate concentration. Under the conditions of 20％ olive oil in isooctane and 25 mM triethanolamine buffer (pH 7.0), operational half life was 220 hr at 30 oC. Glycerol added in the aqueous stream showed stabilizing effect against the organic solvent; half life was extended from 220 hrs to 450 hrs by 15％ glycerol supplemented at 30 oC. The reactor was also operable with n-hexane, but the operational stability of the immobilized enzyme in n-hexane, but the operational stability of the immobilized enzyme in n-hexane was only half of that in isooctane. In case of hydrolysis of olive oil using whole cell in organic aqueous two phae system as a source of lipase. It was found that the strain was grown well in the two-phase system and produced extracellular liphase simultaneously. Among the organic solvent tested, isooctane was the most suitable solvent for this purpose. Hydrolysis of not olive oil but beef tallow which is solid at ambient temperature was found to be feasible in this system.
Enzymatic synthesis of medium-chain glycerides (MCGs) was studied by using capric acid (decanoic acid) and gylcerol as substrates for immobilized lipase (Lipozyme TM) without any solvents or surfactant. Quantitative analysis of the reaction mixture was conducted by using high performance liquid chromatography (HPLC), which enabled the exact tracing of the capric glyceride synthesis. Oletic acid was also used for comparision. The esterification activity of Lipozyme was determined at 40oC in an open batch reactor; the activities were 400 and 200 units/g for the capric glyceride and oleic glyceride synthesis, respectively. Maximum initial reaction rate was obtained at 50oC for capric and 60oC for oleic glyceride synthesis. The time course of the capric glyceride synthesis was compared in terms of different molar ratios, from which we infer that this enzyme is 1,3-specific, but not absolute, in this esterification reaction. The final conversion wasx greatly influenced by the methods used to remove water, among which the cold trap method resulted in a noticeable improvement.
In order to investigate quantitavely in interesterification reaction, triolein and stearic acid were used as substrates and eight commercially available lipases were tested for their suitability for the reaction. Three fungal lipase preparations were found to be suitable. The hydrolytic activity of the commercial lipases was tested with olive oil and it was noted that there was nocorrelation between their hydrolytic and interesterification activities. Among the lipases tested, Mucor miehei lipase was chosen for further study because of its high protein content and its relatively high hydrolytic and interesterification activities, both of which are required for effective interesterification. The effect of water activity on the interesterification reaction was investigated. Interesterification activity was shown to be maximum at the water activity of 0.25. As the water activity of the lipase increased, hydrolysis of triglyceride was accelerated. At zero water activity, high conversion was achieved, although interesterification activity was relatively lower than that at the water activity of 0.25. A new and simple immobilization method was developed in order to render hydrophobicity to the lipase, and hence to improve the interesterification acitivty hydrophobicity to the lipase was immobilized covalently with glutaraldehyde or with six alkyl chains as spacers onto Florisil (magnesium silicate, an inorganic matrix). Interesterification activities of the immobilized lipase with the hydrophobic spacers were increased against that of free lipase. The increase of activity was up 88 folds of the original activity of free lipase when the spacer was 7-aminoheptanoic acid. Relatively high stability of the immobilized lipase was shown in a continuous packed bed column reactor with a half life of 97 days.
Chromobacterium viscosum lipase which was adsorbed on liposome and solubilized in microemulsion droplets of glycerol containing a little amount of water could catalyze the glycerolysis of glycerol containing a little amount of water could catalyze the glycerolysis of olive oil. Studies on the continuous glycerolysis of olive oil by the immobilized enzyme was done at 37oC. in a continuous stirred vessel bioreactor with polysulfone membrane. The effect of the flow rate of substrate (olive oil) in isooctane on the conversion and composition of the outlet was investigated using high-performance liquid chromatography (HPLC). The conversion increased with decrease in the flow rate. And we studied the effect of water content in the glycerol-water-lipase solution on the glycerolysis reaction. The conversion to desirable products, mono- and di- olein, was improved without a substantial production of oleic acid at lower water concentration, i.e., below 8.0 ％(w/v) which corresponds to a Wo value of 0.97. At water concentration higher than 8.0 ％(w/v), the amount of free fatty acid was dramatically increased. Higher operational stability of the enzyme was obtained in theis continuous stirred vessel reactor, and the half-life of the enzyme during the continuous reaction was about 7 weeks.
A gene coding for a thermostable lipase of Pseudomonas fluorescens SIK W1 was cloned into Escherichia coli JM83 by inserting Sau3AI-generated DNA fragments into the BamHI site of pUC19. Twenty colonies with esterase activity on the tributyrin agar plate were isolated by screening the constructed Psedomonas fluorescens genomic libary. Only one out of the esterase positive 20 colonies had lipase activity on the agar plate containing olive oil and Rhodamine-B. The complete nucleotide sequence of the lipase gene was identified. The lipase gene consistws of an open reading frame, 1347bp long, commencing with an ATG start codon encoding a polypeptide of 449 amino acid residcues and a TGA stop codon. Comparison of this lipase amino acid sequence with those from another organisms sequenced to data showed the presence of the short homologous region Gly-X-Ser-X-Gly. A thermostable lipase gene from Pseudomonas fluorescens SIK W1 was overexpressed in Escherichia coli BL21 using experssion vector pTTY2. The amount of lipase produced by E. coli BL21 with pTTY2 was more than 40％ of the tota cell proteins when induced with isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside. (continue)

목차 Contents

• 제 1 세 부 목 차...80
• 제 2 세부목차...162
• 제 3 세부과제...248