보고서 정보
주관연구기관 |
연세대학교 Yonsei University |
연구책임자 |
김윤수
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참여연구자 |
양영호
,
오상환
,
안용호
,
김길영
,
이진성
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발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 1995-10 |
주관부처 |
과학기술부 |
사업 관리 기관 |
연세대학교 Yonsei University |
등록번호 |
TRKO200200014867 |
DB 구축일자 |
2013-04-18
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키워드 |
ALL.Cercical Cancer.Diagnosis.Hamophilia A.Insulin gene.Gene therapy.Porphyria.p53..ALL.Cercical Cancer.Diagnosis.Hamophilia A.Insulin gene.Gene therapy.Porphyria.p53..
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초록
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유전자 기능 이상으로 생기는 여러질환 가운데 5가지 질환을 대상으로 그 진단과 치료를 위한 방법개발을 목적으로 6명의 세부과제 책임자가 공동으로 연구를 수행하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 제1세부과제에서는 선천성 유전병의 하나인 혈우병 A의 조기진단을 목적으로 FVIII 유전자의 intragenic marker (BclI, Xbal)와 extragenic marker (St 14 VNTE)를 중합효소 연쇄 반응 (PCR)법을 이용한 혈우병A의 보인자 및 산전 태아진단을 시도하였고, 이의 유효성을 보기 위하여 융모막 융모샘플링에
유전자 기능 이상으로 생기는 여러질환 가운데 5가지 질환을 대상으로 그 진단과 치료를 위한 방법개발을 목적으로 6명의 세부과제 책임자가 공동으로 연구를 수행하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 제1세부과제에서는 선천성 유전병의 하나인 혈우병 A의 조기진단을 목적으로 FVIII 유전자의 intragenic marker (BclI, Xbal)와 extragenic marker (St 14 VNTE)를 중합효소 연쇄 반응 (PCR)법을 이용한 혈우병A의 보인자 및 산전 태아진단을 시도하였고, 이의 유효성을 보기 위하여 융모막 융모샘플링에 의해 채취한 융모로부터 Y specific DNA sequence (Y-1, Y-2)를 이용 PCR 실시하여 태아의 성판정을 실시하였다. 4예의 혈우병 A 가족에서 FVIII 유전자에 존재하는 BclI과 Xbal에 대한 RFLP 및 St14 VNTR 분석결과 2명의 혈우병 A 보인자를 확인하였고, 이들 가족의 산전 태아진단을 시행한 결과 정상태아 및 정상여성임을 확인하였다. 이같이 혈우병 A 보인자와 산전태아진단에 이 방법이 유용하게 이용될 수 있음을 알게 되었다. 제2세부과제에서는 사람자궁경부암에서 p53 유전자의 변이와 human papillomavirus (HPV)사이의 상관관계를 알아보기 위하여 자궁경부암 64예를 대상으로 HPV E6 concensus primer를 이용한 PCR을 시행하고 HPV type specific probe를 이용한 Southern blot hybridization으로 HPV 감염여부 및 type을 결정하였고 p53 유전자의 변이 검색을 위해 SSCP 분석과 DNA sequencing을 실시한 결과 전체 64예중 46예가 HPV 양성이었고 그중 27예가 HPV type 16과 18이었다. p53 유전자의 염기치환은 8예에서 나타나고 있었으며 이중 6예는 HPV 양성이었다. p53의 과표현 측정을 위해 p53에 대한 항체를 이용한 면역조직 화학 염색을 시행한 결과 전체 64예중 27예에서는 p53의 과표현이 있었으며 그중 21예가 HPV 양성이었다. 이와같은 사실은 내포내 p53 단백질의 기능이상이 원발성 자궁 경부암의 발생과정에 중요한 역할을 한다는 사실을 입증하고 있다. 그러나 HPV 감염과 p53 유전자의 변이는 서로 역상관 관계가 성립되지 않음을 알게 되었다. 제3세부과제에서는 선천적 유전병인 혈우병 A의 유전자 치료를 목적으로 FVIII cDNA중 혈액응고 활성에는 무관한 B-domain을 제거하고 이를 retroviral vector인 LNSX에 삽입한 다음 packaging cell line인 PA317 cell에 transfection시켜 FVIII-B cDNA가 삽입된 retroviral safe vector를 제조하였다. 제조된 vector를 마우스 NIH 3T3 세포에 감염시킨 다음 G418로 선별하여 재조합 FVIII-B 유전자를 가진 retrovirus를 생산하는 PA317 세포주를 얻었으며, 이로부터 생산된 virus 입자를 NIH3T3 세포나 partial hepatectomy를 실시한 백서에 주입한 후 세포배양액과 백서조직 (간, 비장)에서 FVIII-B가 발현되고 있음을 RT-PCR, Northern blot hybridization, ELISA 그리고 immunohistochemical staining을 실시하여 확인하였다. 제4세부과제에서는 당뇨병의 유전자 치료를 목적으로 proinsulin 유전자를 transfection시킨 세포에서 인슐린을 분비할 수 있는 세포주를 개발하고자 하였다. 이러한 목적을 달성하기 위하여 췌장의 β세포에서 포도당 농도에 따른 인슐린분비의 조절에 포도당 운반체 (GLUT2)가 관여할 것으로 생각되므로 GLUT2 유전자와 proinsulin 유전자를 각각 eukaryotic expression vector에 삽입하고 이를 Chinese hamster ovary (CHO) 세포에 transfection 시킨다음 G418을 이용한 선별과정을 거쳐 계대배양하여 3가지 clone을 얻었고 이들 세포에서 인슐린 유전자가 발현되고 합성된 인슐린이 세포배양액으로 유출되고 있는 사실을 Northern blot 및 Western blot immunostaining으로 확인하였다. 제5세부과제에서는 급성 임파구성 백혈병을 분자면역학적 방법과 유전자 분석법에 따라 정확하게 분류하여 치료효과를 높이고 보다 신속한 예후판정을 얻기 위하여 ALL 환자 21예를 대상으로 T세포에 대한 단클론 항체(CD 계열)를 이용한 면역학적 분류를 시행한 결과 B세포계열 ALL이 16예 T세포계열 ALL이 3예, 잡종백혈병이 1예로 분류되었다. 면역글로불린(Ig)과 T세포수용체 유전자의 재배열 검사를 통한 분류에 따르면 B 세포계열 16예중 IgH 유전자 재배열이 15예였으며, IgK 유전자 재배열은 6예였다. 그리고 T세포 수용체 β 유전자 재배열은 B 세포계열 16예중 4예에서 관찰되었고 T세포 수용체 γ 유전자 재배열이 7예에서 관찰되었다. T세포계열 3예모두에서는 T세포 수용체 β와 γ 유전자의 재배열이 있었으나 IgH와 IgK 유전자 재배열은 없었다. 즉 면역학적 검사방법에 따른 분류와 유전자 재배열 검사방법에 따른 분류는 거의 일치하고 있어 백혈병 분류에 유용하게 이용될 수 있음을 알게 되었다. 제6세부과제에서는 한국에서 급성 간헐성 포르피리아 (AIP) 환자의 분자 유전학적 진단 및 원인 분석을 위하여 가계가 다른 4명의 환자를 대상으로 실험에 착수하였다. AIP는 porphobilinogen deaminase (PBG)유전자의 결함으로 생기는 상염색체성 우성 유전병으로 유전자의 변이가 특징이다. 이들 환자의 혈액으로부터 DNA를 추출하고 이를 template로 하여 PCR 증폭하고 direct sequencing 한결과 exon 3에 3개의 염기(GTT, Val) 훼손과 exon 7에 두군데 점변이 (G->A. at codon 94; C->T at codon 208)가 있었으며 intron 10에 한 개의 염기서열 이상이었음을 알게되었다. 이상과 같은 실험 결과를 종합해 볼 때 유전자 기능 이상으로 오는 질환의 조기 진단을 위한 새로운 분자 유전학적 진단방법이 매우 유용하게 응용될 수 있으며 환자의 분류 및 치료 효과 증대를 위한 도구로 이용될 수 있을 것으로 생각된다. 선천성 유전병은 물론 기타 유전자 기능장애로 오는 질병을 근본적으로 치료할 수 있는 유전자 치료방법에 대한 기초연구는 앞으로 암과 당뇨병같은 난치병 치료에 크게 공헌할 수 있을 것으로 생각된다.
Abstract
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In the present studies, 6 principal investigators with different subjects were collaborated on the research for the development of diagnostic and therapeutic methods related to 5 different diseases associated abnormal with gene functions. In the first subject, an attempt to judge the usefulness of
In the present studies, 6 principal investigators with different subjects were collaborated on the research for the development of diagnostic and therapeutic methods related to 5 different diseases associated abnormal with gene functions. In the first subject, an attempt to judge the usefulness of prenatal diagnosis of hemophilia A using intragenic markers (BclI, Xbal) and an extragenic marker (St14VNTR) in PCR amplified DNA. Sex determination of fetus was performed by the amplification of Y specific DNA sequence using Y specific primers (Y-1, Y-2). Two Hemophilia A alleles were identified in four hemophilia A patients by BclI and Xbal RFLP or by ST14VNTR analysis. Prenatal diagosis of hemophilia A in two hemoplilic families showed normal alleles in both fetus and mother. These results indicate that the above methods will be applicable in the prenatal diagnosis of hemophilia A. In the second subject, the relationship between p53 gene mutations and human papillomavirus (HPV) gene product in human cervical cancer has been determined. HPV infection was determined in 64 cervial cancer patients by the Southern blot hybridization of the PCR amplified HPV E6 concensus sequence with HPV type specific probes. SSCP analysis and DNA sequencing were perfomed in order to detect the mutation in p53 gene, and the overexpression of p53 was determined by immunohistochemical staining method using a anti-p53 antibody. Among 64 cervical cancer patients, 46 were HPV positive, of which 27 being HPV type 16 and 18. Base substitutions of p53 gene were found in 8 cases (6 HPV positive and 2 HPV negative). Overexpression of p53 protein was observed in 27 cases, of which 21 cases were HPV positive out of all 64 cases. These results indicate that functional abnormality of p53 protein may have an important role in the tumorigenesis of primary cervical cancer and that the inverse relationship between HPV infection and p53 mutation does not exist. In the third subject, a retroviral safe vector harboring the FVIII-B, a B-domain deleted FVIII cDNA, was made by inserting it into a retroviral vector (LNSX) and packaging it in PA317 cell line, in order to use in the gene therapy for hemophilia A, a hereditary disease in male children. The retroviral safe vector producing PA317 cells were screened by G418 after the transfection of mouse NIH 3T3 cells with the cultured media of PA317. Two clones that produce the recombinant FVIII-B were prepared and the retroviral safe vector expressing the recombinant FVIII-B were harvested and transfected into mouse NIH 3T3 cells or transfused into the partially hepatectomized rats to produce the FVIII-B in NIH 3T3 cells or in rat liver. The expression of FVIII-B in the mouse NIH3T3 cells were confirmed by RT-PCR, Northern blot hybridization and ELISA. The FVIII-B protein in the liver of rats was identified by immunohistochemical staining. In the fourth subject, the establishment of an insulin secreting cell line has been attempted by the cotransfection of a proinsulin gene expression vector and a GLUT2 gene expression vector into Chinese hamster ovary (CHO) cells. Since it is assumed that glucose transporter(GLUT2) is involved in the insulin secretion in pancreatic β cell, GLUT2 gene and proinsulin gene were inserted into a eukaryotic expression vector and were transfected into CHO cells, followed by a selection with G418. Three clones that express and secrete insulin into culture media were identified by Northern blot hybridization and Western blot immunostaining. In the fifth subject, classification of acute lymphocytic leukemia (ALL) was made by the molecular immunological method and molecular genetic analysis method in order to improve the therapeutic effect of a anticancer agent by the precise classification and prognosis of the disease. Classification of 21 ALL patients by immunological method using anti-T cell surface antigen (CD-series) monoclonal antibodies showed 16 ALL cases being B-cell origin, 3 cases being T cell origin and 1 case being complex leukemia. Translocation of IgH was observed in 15 out of 16 cases of B cell line and the translocation of IgK was observed in 6 cases. Translocation of TCRβ gene was observed in 4 out of 16 cases in B cell line and the translocation of TCR γ gene was observed in 7 cases. Translocations of TCRβ and TCRγ were observed in all 3 cases of T cell line but no translocations of IgH or IgK were observed in these cases. The classification of ALL by Ig translocation was well agreed with that of immunological method, and it may be useful for the application in the classification of leukemia (ALL). In the sixth subject, molecular genetic analysis of acute intermittent porphyria (AIP) in 4 unrelated porphyria patients was performed in order to understand the molecular mechanisms of porphyria in Korean patients. AIP is caused by a defect in porphobilinogen (PBG) deaminase gene with an autosomal dominant fashion. DNAs were prepared from peripheral blood obtained from each patient and was used as the template in PCR for the amplification of PBG deaminase gene. Direct sequencing of the amplified gene showed deletion of 3 bases (GTT, val) at exon 7, point mutations at codon 94 (G->A) and at codon 208 (C->T) were observed. A sequence polymorphism at intron 10. In summary, new molecular genetic analysis methods for the diagnosis of diseases associated with abnormal functions of the respective genes will be useful in the classification and identification of the diseases. In addition, the performance of basic research for gene delivery system for the treatment of genetic diseases is a significant step in the advancement of gene therapy.
목차 Contents
- 제 1 세부과제 요약문...10
- 제 1 세부과제 목차...12
- 제 2 세부과제 요약문...28
- 제 2 세부과제 목차...30
- 제 3 세부과제 요약문...64
- 제 3 세부과제 목차...66
- 제 4 세부과제 요약문...90
- 제 4 세부과제 목차...92
- 제 5 세부과제 요약문...113
- 제 5 세부과제 목차...117
- 제 6 세부과제 요약문...139
- 제 6 세부과제 목차...141
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