초록 ▼

p53 유전자의 변화는 인간의 여러 암에서 가장 흔하게 발견되며 종양 세포내에서는 이러한 변형된 p53 단백질의 양의 증가가 초래된다. 세포내에 축적된 p53단백질의 발견은 인간의 암의 예후(prognosis)를 판단할 유용한 기준이 되기도 한다. 본 연구에서는 이러한 면역조직화학 검사에 쓰일 수 있는 폴리클로날 항체를 만들기 위하여 사람의 p53 유전자를 glutathione S-transferse와의 융합 단백질의 형태로써 대장균내에서 발현시켰다. p53의 아미노산 1-158번을 코딩하고 있는 NcoI fragment

p53 유전자의 변화는 인간의 여러 암에서 가장 흔하게 발견되며 종양 세포내에서는 이러한 변형된 p53 단백질의 양의 증가가 초래된다. 세포내에 축적된 p53단백질의 발견은 인간의 암의 예후(prognosis)를 판단할 유용한 기준이 되기도 한다. 본 연구에서는 이러한 면역조직화학 검사에 쓰일 수 있는 폴리클로날 항체를 만들기 위하여 사람의 p53 유전자를 glutathione S-transferse와의 융합 단백질의 형태로써 대장균내에서 발현시켰다. p53의 아미노산 1-158번을 코딩하고 있는 NcoI fragment와 아미노산 159-393번을 코딩하는 NcoI-BamHI fragment를 BamHI linker를 이용하여 in frame으로 삽입하여 재조합 플라스미드 pGTNS와 pGTNL을 각각 만들었다. 또 PCR에 의한 증폭에 의하여 아미노산 38-145번을 코딩하는 유전자 부위를 증폭하였으며 BamHI과 PvuII로 절단하여 pGEX-2T의 BamHI과 SmaI 자리에 삽입함으로써 pGTBP를 제조하였다. 이들 재조합 균주들을 IPTG로 4시간 induction 한 후 세포 추출물로부터 glutathione sepharose bead를 이용하여 융합단백질을 분리하였다. bead에 결합된 단백질은 10% SDS-polyacrylamide gel에서 전기영동 하였으며, 각각의 분자량은 54kDa, 53kDa와 40kDa 였다. 이러한 방법으로 1리터 배양으로부터 약 1㎎의 단백질을 정제하였으며, 분해된 작은 band들은 electroelution을 통해 제거하였다.

Abstract ▼

In order to make polycional antibodies for immunohistochemical screening, human p53 gene was expressed in E. coli in the form of GST fusion proteins. Two p53 gene fragments, which were NcoI small fragment encoding amino acid residues of 1-158 and NcoI large fragment of 159-393, were subcloned into

In order to make polycional antibodies for immunohistochemical screening, human p53 gene was expressed in E. coli in the form of GST fusion proteins. Two p53 gene fragments, which were NcoI small fragment encoding amino acid residues of 1-158 and NcoI large fragment of 159-393, were subcloned into the unique BamHI site present sithin the pGEX-2T vector using BamHI linker and recombinant plasmids pGTNS and pGTNL were constructed, respectively. The p53 cDNA fragment encoding amino acid 38-145 was amplified by PCR. The amplified DNA was digested with BamHI and PvuII and inserted into the BamHI-SmaI sites of pGEX-2T and recombinant plasmid pGTBP was constructed. After IPTG induction of these plasmids for 4 hours, fusion proteins were purified from E. coli extracts with glutathione sepharose beads. The bound proteins were resolved by 10% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and the molecular weights were 54kDa, 53kDa and 40kDa, respectively. Approximately one milligram of fusion proteins were purified from 1-liter culture and degradative small bands were eliminated by electroelution.

목차 Contents

• 2. 서론...8
• 3. 재료 및 방법...9
• 4. 결과...11
• 5. 고찰...23
• 6. 감사의 말...25
• 7. 참고 문헌...26
• 8. Abstract...31
• 9. 논문 발표 계획...32
• 10. 학위 배출 실적...33