초록 ▼

본 연구는 DNA 상해요인에 의한 DNA 복제억제와 그 회복기작을 규명하기 위하여 자외선을 조사한 포유동물 배양세포에서 복제억제의 회복과정에 새로운 복제원점(replication origin)이 사용되는지, 또 이들과 핵기질 (nuclear matrix) 과 어떤 관련성이 있는 지를 조사하였다. 먼저 새로운 복제원점이 복제억제의 회복과정에 관여하는 지를 규명하기 위하여 DNA 합성율에 미치는 자외선의 전처리 효과와 새로 합성된 DNA 분자의 크기 분포, 그리고 이들의 성장양상을 조사하였다. HeLa와 LP1-1 세포에서 낮은 선량의

본 연구는 DNA 상해요인에 의한 DNA 복제억제와 그 회복기작을 규명하기 위하여 자외선을 조사한 포유동물 배양세포에서 복제억제의 회복과정에 새로운 복제원점(replication origin)이 사용되는지, 또 이들과 핵기질 (nuclear matrix) 과 어떤 관련성이 있는 지를 조사하였다. 먼저 새로운 복제원점이 복제억제의 회복과정에 관여하는 지를 규명하기 위하여 DNA 합성율에 미치는 자외선의 전처리 효과와 새로 합성된 DNA 분자의 크기 분포, 그리고 이들의 성장양상을 조사하였다. HeLa와 LP1-1 세포에서 낮은 선량의 자외선을 전처리하면 그후 높은 선량만 단독 처리한 경우보다 DNA 복제억제가 감소함을 발견하였다. 그러나 색소세포건피증 변형세포 (XP variant)에서는 이러한 현상을 볼 수 없었다. 또한 HeLa와 LP1-1 세포에서의 DNA 합성율은 자외선 조사 후 2 시간 이내에 대조군 수준으로 회복되었으나, XP 변형 세포에서는 이와 같은 회복을 관찰 할 수 없었다. 뿐만아니라 알카리 자당농도 구배 초원심법으로 분석한 결과 HeLa 와 LP1-1 세포에서 새로 합성된 DNA 분자의 크기는 자외선 조사 후 3-6 시간에도 대조군의 크기에 이르지 못하였다. 그러나 이들의 성장 양상은 대조군에 비해 별 차이가 없었다. 이와같은 결과는 HeLa 와 LP1-1 세포에서는 새로 합성된 작은 크기의 DNA가 숫적으로 증가하여, 즉 새로운 복제원점을 사용하여 복제억제를 회복하고, 또 새로 합성된 DNA의 성장을 유발하게 되지만, XP 변형세포에서는 이러한 기작이 결핍되어 있음을 시사하는 것이다. 새로운 복제원점과 정상적인 복제원점과의 특성을 비교하기 위해 먼저 정상적인 복제원점과 핵기질과의 관련성을 조사한 결과, 복제원점이 핵기질과 결합되어 있으며 복제가 핵기질상에서 일어남을 알 수 있었다. 새로운 복제원점과 핵기질과의 관련성 역시 DNase 분해 방법으로 조사하였다. lp1-1 세포에서 parental DNA 가 핵기질에 결합하는 율은 자외선 조사후 2시간에 대조군의 7배까지 증가 하다가 그 후 감소하였으며, 자외선 10J/㎡ 까지는 증가하다가 선량증가에 따라 감소하였다. 따라서 새로운 복제원점은 일시적으로 핵기질에 결합하며, 활성화될 수 있는 수효는 제한되어 있다고 생각된다. 또 XP 변형세포에서 복제억제가 회복되지 못하는 것은 새로운 복제원점이 핵기질에 부가적으로 결합하지 못한, 즉 활성화되지 못한 결과에 기인하는 것이라 사료된다. 결론적으로 포유동물세포에서 자외선에 의한 복제억제의 회복기간은 DNA 회복합성, 새로운 복제원점의 활성화등 적어도 두가지 요인을 포함한다.

Abstract ▼

The present study attempted to investigate the replication inhibition and its recovery mechanism in ultraviolet(UV)-irradiated mammalian cells in vitro. The specific aims were to determine the activation of new replication origins for the recovery, the relationship between the new origins and nuclea

The present study attempted to investigate the replication inhibition and its recovery mechanism in ultraviolet(UV)-irradiated mammalian cells in vitro. The specific aims were to determine the activation of new replication origins for the recovery, the relationship between the new origins and nuclear matrix. The effefct of UV-pretreatment and distribution of nascent DNA molecules and their gowth pattern were analyzed. The pretreatment of a low dose of UV light reduced the ingibition of DNA synthesis by following exposure of challenging dose in HeLa or LP1-1 cels. However, this reduced inhibition of replication was not found in xeroderma pigentosum(XP) variant cell lines. The rate of DNA synthesis was also recovered from the inhibition to control value within 2hr after UV-irradiation in HeLa and LP1-1 cells, but not in XP variant cells. These results suggest that the pretreatment of UV light may induce the use of alternative replication origin or trans-lision process in HeLa nd LP1-1 cells, but not in XP variant cells. The weigth average molecular weights(Mws) of nascent DNA in UV-irradiated HeLa and LP1-1 were still smaller than those of unirradiated control as determined by alkaline sucrose gradient sedimentation. The growth patterns of the nascent DNA molecules of UV- irradiated cells, however, were similar to those of unirradiated control cells. the increase in the number of newly synthesized smal fragment means the activation of the new replocation origin, suggesting that the alternative new origins involved in the recovery and the growth of nascent DNA molecules in UV-irradiated HeLa and LP1-1 cells, but those processes be defect in XP variant cells, but those processes be defect in XP variant cells. To compare the new replication origin with normal one in their nuclear matrix-binding, the relationship between normal replication origin and nuclear matrix was primarily analyzed by DNase-digestion of the halo structure in synchronized LP1-1 cells. The result shown that the replication origins are associated with the nuclear matrix and DNA replication occurs at the nuclear matrix. The relationship between new replication origin and nuclear matrix was also analyzed by DNase-diestion method in LP1-1 cells irradiated with UV light. The matrix-binding of parental DNA was drastically increased to 7-fold of that of control cells 2 hr after UV-irradiation and then decteased as a time dependent manner, and decteased by exposure to over 10J/㎡ UV-light as a dose dependent manner. These findings suggest that the matrix-binding of new replication origins be transient and limited in its number. Conclusionally, in the recovery of DNA synthesis in UV-irradiated mammalian cells at least two factors, such as excision repair and activation of new replication origins, are participated.

목차 Contents

• V. 본문...7
• 1. 연구 배경...7
• 2. 연구 내용범위 및 방법...11
• 1) 연구내용과 범위...11
• 2) 재료 및 방법...12
• 2-1) 실험재료 및 세포배양...12
• 2-2) DNA 합성율 측정 실험...12
• 2-3) 알칼리 자당 농도구배 초원심 분리 실험...13
• 2-4) 핵기질(nuclear matrix)의 추출및 DNase 분해...15
• 3. 연구결과...16
• 1) 사람 HeLa세포와 mouse LPI-1세포의 절제회복능 비교...16
• 2) DNA합성율에 미치는 자외선 전처리 효과...16
• 3) DNA 합성율의 회복양상...17
• 4) 새로 합성된 DNA분자들의 크기분포및 성장양상...17
• 5) 시간경과에 따른 Parental DNA의 핵기질 결합량 변화...18
• 4. 고 찰...20
• VI. 인 용 문 헌...23
• VII. 논문발표 계획...25
• VIII. 학위배출 실적...25