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문제 정의
- 이와 같은 외래유전자의 silencing 현상을 효과적으로 조절하여 형질전환의 효율을 높이기 위해서는 silencing 과정 및 현상을 연구하는 것이 필요하다. 본 연구에서는 형질전환 토마토에서 NPTII 유전자 및 TPSP 유전자 발현양상을 분석하여 토마토에서 transgene silencing 현상을 연구하고자 하였다.
- 본 연구에서는 형질전환 토마토에서 NPTII 유전자 및 TPSP 유전자의 copy number 및 mRNA 발현변화, 그리고 DNA methylation 축적여부를 조사 하였다. 형질 전환과정에서 kanamycin에 저항성을 보이며 선발된 토마토 형질전환 체중에서, 1 번 line과 11번 linee NPTII 및 TPSP 유전자가 여러 copy로 도입되었으나, 후대에서 외래유전자의 mRNA가 발현되지 않았고 kanamycin 저항성을 보이지 못했다 (Figure 1, 2, 3), 11번 line의 경우 methylation sensitive 제한효소를 이용한 methylation 분석 결과 외래유전자의 coding 부위 및 CaMV35S promoter 부위에서 CpG methylaiton이 축적되었음을 확인하였다 (Figure 4).
제안 방법
- 형질전환체에서 분리한 60 ㎍의 genomic DNA를 methylation sensitive 제한효소인 HpaU 처리 및 methylation insensitive 제한효소인 MspI 처리하여 표준방법으로 Southern 분석을 수행하였다. 0.4 ~ 1.1 kb의 TPSP probe 를 사용하여 TPSP coding region에서의 CpG methylation 변화를 조사하였다. 이후 membrane을 1% SDS와 1 mM EDTA 가 첨가된 95 ℃ 의 deprobing 용액에 30분간 처리 후, CaMV 35S promoter 단편으로 re-probing하여 도입유전자의 promoter 부위에서의 CpG methylation 변화를 조사하였다.
- Joyfiil)의 자엽절편과 pHC21-TPSP벡터를 가진 Agorbacterium tumefacience LBA4404을 공동배양하여 형질전환을 수행하였다. 2 mg/L zeatin, 0.1 mg/L IAA, 350 mg/L carbenicillin, 100 mg/L kanamycin이 첨가된 MS배지에서 배양 1개월 이후 kanamycin에 저항성을 보이며 발생한 shoot을 350 mg/L carbenicillin, 100 mg/L kanamycin, 0.5 mg/L indole butryic acid (IBA)이 첨가된 MS배지에서 뿌리를 유도하여 2차 선발하였다. 이렇게 kanamycin에 저항성을 보이며 선발된 유식물체는 화분에 옮겨 생육시켜 후대 종자를 수확하였다.
- Probe제작을 위한 DNA 단편은 형질전환벡터 pHC21-TPSP를주형으로 하고 해당 primer를 이용하여 PCR방법으로 준비하였다. 700 bp 의 NPTII DNA 단편은 NPTII-F(5, -GAGGCTAT TCGGCTATGACTG3)와 NPTU-R(5'-ATCGGGA GCGGCGATA CCGTA-3') primer를 사용하고, 750 bp의 TPSP DNA 단편은 TPSP-F(5, -GAAAATATTCCGCTACTCTGAC-3, )와 TPSP-R(5 '-GATACTGAGCGATGACTGTATG-3') primer 를사용하여 PCR방법으로 증폭하여 분리하였다. 이후 [a-322p] dCTP로 표지하여 probe로 사용하였으며, Imaging Plate (Fiyifilm, Japan) 또는 X-ray film을 이용하여 노출하였다.
- 1 kb크기의 DNA 단편을 사용하였다. Probe용 CaMV35S promoter는 pHC21-TPSP를 주형으로 하고 35S For (5‘- ATCACGCACAATCCCACTAT-3')/35S 3(5'-ATAGT GGGATTGTGCGTCAT-3”)primer로 PCR을 수행하여 증폭된 약 800 bp의 DNA 단편을 사용하였다.
- Ti 세대에서의 copy number 및 유전자의 발현을 조사하였다. 1, 2, 10, 11번 line에서 각각 1 개체씩을 선별하여 copy number를 분석한 결과, 1번과 11번은 역시 여러 copy의 외래유전자가 도입되어 있었으며, 2번의 경우 2 copy, 10번의 경우 1 copy로 확인되 었다 (Figure IB).
- 유전자를 가진 11번 line의 후대 종자 (T. or T, 를 Kanamycin이 첨가된 MS 배지에서 발아시켜 항생제 저항성을 조사하였다 (Fig 2). Kanamycin이 첨가되지 않은 배지에서는 2번 line과 11번 line이 모두 wild type과 동일하게 발아후 생장하였다.
- (Figure 4C). 따라서 HpaII 또는 MsPI 처리한 후 Southern 분석으로 TPSP 유전자 부위 및 CaMV35S promoter 주위의 methylation 유무를 확인하였다 (Figure 4). 2번 line의 경우 TPSP 유전자를 probe로 사용한 경우 및 CaMV35S promoter를 probe로 사용한 경우 모두 Hpall를 처리한 것과 MspI을 처리한 것에서 동일한 밴드 양상을 보였으나, 11번 line의 경우는 밴드 양상이 변하였다.
- 이러한 사실은 선발과정을 거쳐서 형질전환체를 확보하여도 도입한 유전자의 발현 양 및 안정적 발현이 예측될 수 없음을 나타낸다. 본 연구에서는 Kanamycin에 저항성을 보이며 선발되었고, PCR로 NPTII 유전자의 도입이 확인된 토마토 형질전환식물체 1, 2, 10, 11 line의 To 식물에서 southern 분석을 수행하여 NPT11 유전자의 copy number를 조사하였다(Figure 1A). NPTII 및 TPSP유전자를 probe로 분석한 결과 1 번, 11 번 line의 형질전환체는 여러 copy의 유전자를 가지고 있었고, 2번, 10번 line들은 1-2 copy의 외래유전자의 도입이 확인되었다 (Figure 1).
- 그러나 TGS의 경우 핵 내에서 전사가 일어나지 것이므로 mRNA가 전사되지 않을 것이다. 본 연구의 형질전환체 11번 linee Northern상에서 전혀 유전자의 발현을 볼 수 없기 때문에 TGS로 의심되었다. 고등식물에서 TGS의 경우 해당 유전자 및 promoter 부위에서 CG methylation 이 일어나게 된다 (Matihieu and Bender 2004, Haque et al.
- 온실조건에서 생장한 토마토 식물체의 잎을 채취하여 DNA와 RNA를 분리하여 분석하였다. Genomic DNA 분리, PCR, 전기영동, Southern 분석은 표준방법을 사용하였다 (Sambrook and Russell 2001).
- 700 bp 의 NPTII DNA 단편은 NPTII-F(5, -GAGGCTAT TCGGCTATGACTG3)와 NPTU-R(5'-ATCGGGA GCGGCGATA CCGTA-3') primer를 사용하고, 750 bp의 TPSP DNA 단편은 TPSP-F(5, -GAAAATATTCCGCTACTCTGAC-3, )와 TPSP-R(5 '-GATACTGAGCGATGACTGTATG-3') primer 를사용하여 PCR방법으로 증폭하여 분리하였다. 이후 [a-322p] dCTP로 표지하여 probe로 사용하였으며, Imaging Plate (Fiyifilm, Japan) 또는 X-ray film을 이용하여 노출하였다.
- 1 kb의 TPSP probe 를 사용하여 TPSP coding region에서의 CpG methylation 변화를 조사하였다. 이후 membrane을 1% SDS와 1 mM EDTA 가 첨가된 95 ℃ 의 deprobing 용액에 30분간 처리 후, CaMV 35S promoter 단편으로 re-probing하여 도입유전자의 promoter 부위에서의 CpG methylation 변화를 조사하였다. Probe용 TPSP는, 2.
- 토마토 형질전환체에서 NPTII 및 TPSP유전자의 발현양상을 조사하였다. 4개 line 토마토 형질전환체가 선발 배지에서 kanamycin에 저항성을 보이며 생산되었다.
- 형질전환 유전자의 CaMV35S promoter 부위 및 TPSP 유전자 부위의 CCGG 염기서열에서의 CpG methylation 축적 여부를 조사하였다. 형질전환체에서 분리한 60 ㎍의 genomic DNA를 methylation sensitive 제한효소인 HpaU 처리 및 methylation insensitive 제한효소인 MspI 처리하여 표준방법으로 Southern 분석을 수행하였다.
- 조사하였다. 형질전환체에서 분리한 60 ㎍의 genomic DNA를 methylation sensitive 제한효소인 HpaU 처리 및 methylation insensitive 제한효소인 MspI 처리하여 표준방법으로 Southern 분석을 수행하였다. 0.
대상 데이터
- 이후 membrane을 1% SDS와 1 mM EDTA 가 첨가된 95 ℃ 의 deprobing 용액에 30분간 처리 후, CaMV 35S promoter 단편으로 re-probing하여 도입유전자의 promoter 부위에서의 CpG methylation 변화를 조사하였다. Probe용 TPSP는, 2.24 kb의 TPSP cDNA를 BamWBgUl 제한효소로 처리하여 분리된 0.4 ~ 1.1 kb크기의 DNA 단편을 사용하였다. Probe용 CaMV35S promoter는 pHC21-TPSP를 주형으로 하고 35S For (5‘- ATCACGCACAATCCCACTAT-3')/35S 3(5'-ATAGT GGGATTGTGCGTCAT-3”)primer로 PCR을 수행하여 증폭된 약 800 bp의 DNA 단편을 사용하였다.
- 형질전환 토마토로부터 분리한 60 ug의 genomic DNA를 HindUl 제한효소로 처리하여 copy number조사를 위한 Southern 분석에 이용하였다. TRI Reagent (Molecular Research Center, Cincinnati, OH, USA)를사용하여 전체 RNA를 분리하였고 30 ㎍의 전체 RNA를 Northern 분석에 사용하였다. 전체 RNA의 전기 영동 및 Northern 분석은 표준방법을 사용하였다 (Sambrook and Russell 2001).
- 즉, DNA 염기서열 중에서 CG 서열이 나타날 경우 C에 methyl기가 첨가되어 promoter부위에 methylation 이 축적됨으로써 RNA polymerase에 의한 mRNA의 전사가 억제된다. 본 연구에 사용된 TPSP 유전자 및 NPTII 유전자의 coding region, 그리고 TPSP 및 NPTII 유전자의 promoter인 CaMV35S promoter 주위에는 제한효소인 HpaII와 MspI이 절단할 수 있는 부위인 CCGG 서열이 여러 개 존재한다. (Figure 4C).
- 사용된 TPSP 유전자는 명지대학교 김주곤 교수에게서 분앙받았다 MS 배지에서 발아된 방울 토마토 (Lycopersicon esculentum Mill cv. Joyfiil)의 자엽절편과 pHC21-TPSP벡터를 가진 Agorbacterium tumefacience LBA4404을 공동배양하여 형질전환을 수행하였다. 2 mg/L zeatin, 0.
- 형질전환 벡터는 pCAMBLA 2300 vector에 CaMV35S promoter 와 not terminator의 조절을 받는 NPTII 유전자 및 TPSP 유전자가 연결된 pHC21-TPSP 벡터 (Figure 4C)를 사용하였다. 사용된 TPSP 유전자는 명지대학교 김주곤 교수에게서 분앙받았다 MS 배지에서 발아된 방울 토마토 (Lycopersicon esculentum Mill cv.
이론/모형
- RNA를 분리하여 분석하였다. Genomic DNA 분리, PCR, 전기영동, Southern 분석은 표준방법을 사용하였다 (Sambrook and Russell 2001). 형질전환 토마토로부터 분리한 60 ug의 genomic DNA를 HindUl 제한효소로 처리하여 copy number조사를 위한 Southern 분석에 이용하였다.
- TRI Reagent (Molecular Research Center, Cincinnati, OH, USA)를사용하여 전체 RNA를 분리하였고 30 ㎍의 전체 RNA를 Northern 분석에 사용하였다. 전체 RNA의 전기 영동 및 Northern 분석은 표준방법을 사용하였다 (Sambrook and Russell 2001). Probe제작을 위한 DNA 단편은 형질전환벡터 pHC21-TPSP를주형으로 하고 해당 primer를 이용하여 PCR방법으로 준비하였다.
- Genomic DNA 분리, PCR, 전기영동, Southern 분석은 표준방법을 사용하였다 (Sambrook and Russell 2001). 형질전환 토마토로부터 분리한 60 ug의 genomic DNA를 HindUl 제한효소로 처리하여 copy number조사를 위한 Southern 분석에 이용하였다. TRI Reagent (Molecular Research Center, Cincinnati, OH, USA)를사용하여 전체 RNA를 분리하였고 30 ㎍의 전체 RNA를 Northern 분석에 사용하였다.
성능/효과
- 본 연구에서는 Kanamycin에 저항성을 보이며 선발되었고, PCR로 NPTII 유전자의 도입이 확인된 토마토 형질전환식물체 1, 2, 10, 11 line의 To 식물에서 southern 분석을 수행하여 NPT11 유전자의 copy number를 조사하였다(Figure 1A). NPTII 및 TPSP유전자를 probe로 분석한 결과 1 번, 11 번 line의 형질전환체는 여러 copy의 유전자를 가지고 있었고, 2번, 10번 line들은 1-2 copy의 외래유전자의 도입이 확인되었다 (Figure 1).
- 2번 line의 경우 TPSP 유전자를 probe로 사용한 경우 및 CaMV35S promoter를 probe로 사용한 경우 모두 Hpall를 처리한 것과 MspI을 처리한 것에서 동일한 밴드 양상을 보였으나, 11번 line의 경우는 밴드 양상이 변하였다. TPSP를 probe로 사용하면, 2번 line에서는 CCGG서 열 부위가 절단된 경우 예상되는 230, 350, 420, 600 bp의 TPSP 단편들이 Hpall 또는 MspI으로 처리구에서 동일한 양상으로 나타났다. 그러나 11번 line에서는 HPall 처리구에서는 나타나지 않았던 밴드들이 MspI 처리구에서 나타났다.
- 그러나 Kanamycin이 첨가된 배지에서는, 2번 linee 저항성을 보이며 정상적으로 발아하여 유식물체로 생장하였지만, 11번 linee wild type과 동일하게 Kanamycin에 저항성을 보이지 못하고 유식물체로 발달하지 못하였다 (Figure 2). 그렇지만 Kanamycin에서 생육하지 못한 11번 line의 유식물체들은 PCR 분석 결과 NPTII 유전자를 가지고 있음이 확인되었다 (데이터 미제시). 이것은 11번 line에서 NPTII 유전자가 후대로 전달되었으나, 이 식물체에서는 Kanamycin 에 저항성을 부여하는 neomycin phosphotransferase II 단백질이 생산되지 않았음을 나타낸다.
- 형질전환 line 11 번은 methylation sensitive 제한효소처 리 후 DNA methylation분석 결과, TPSP coding부위 및 도입 유전자의 발현을 조절하는 CaMV35S 프로모터 주위에서 CpG methylation이 축적되었음이 확인되었다. 따라서 여러 copy의 외래유전자를 가진 토마토 형질전환 line 11 번에서 NPTII 유전자 및 TPSP유전자의 발현이 억제된 것은 transcriptional gene silencing 기작에 의한 것으로 추정되었다.
- 즉 Msple CC*GG의 경우 절단할 수 있으나, G C*C*GGN와 같이 바깥쪽의 C도 CpG methylation이 일어나면 절단하지 못하는 특성 때문으로 생긱된다. 이상의 결과로 11 번 line에서 NPTII 유전자와 TPSP 유전자가 발현되지 않는 이유는, 외래유전자가 여러 copy로 도입되었으며 유전자의 coding region 및 promoter 부위에서 CpG methylaiton에 의한 transgene silencing때문으로 생각된다.
- 형질 전환과정에서 kanamycin에 저항성을 보이며 선발된 토마토 형질전환 체중에서, 1 번 line과 11번 linee NPTII 및 TPSP 유전자가 여러 copy로 도입되었으나, 후대에서 외래유전자의 mRNA가 발현되지 않았고 kanamycin 저항성을 보이지 못했다 (Figure 1, 2, 3), 11번 line의 경우 methylation sensitive 제한효소를 이용한 methylation 분석 결과 외래유전자의 coding 부위 및 CaMV35S promoter 부위에서 CpG methylaiton이 축적되었음을 확인하였다 (Figure 4). 따라서 토마토 11번 line어서 NPTII 유전자 및 TPSP 유전자의 silencinge methylation 에 의해 매개된 TGS 기작 때문인 것으로 추정된다.
- Southern 분석 결과, 1번 11번 linee 여러 copy의 외래 유전자를 가지고 있었으며, 2번, 10번 linee 1-2 copy의 외래유전자를 가지고 있었다. 형질전환 line 11 번은 methylation sensitive 제한효소처 리 후 DNA methylation분석 결과, TPSP coding부위 및 도입 유전자의 발현을 조절하는 CaMV35S 프로모터 주위에서 CpG methylation이 축적되었음이 확인되었다. 따라서 여러 copy의 외래유전자를 가진 토마토 형질전환 line 11 번에서 NPTII 유전자 및 TPSP유전자의 발현이 억제된 것은 transcriptional gene silencing 기작에 의한 것으로 추정되었다.
- 옮겨져 생육되었다. 화분에서 생육하는 조건은 Kanamycin 에 의한 선발압력이 사라진 조건으로서, 이렇게 생장한 T0 세대에서 NPTII 유전자 및 TPSP 유전자의 발현을 분석한 경우에 형질전환체에 따라서 유전자의 발현 양상은 northern 으로 감지되지 않을 정도의 낮은 수준부터 높은 발현 수준까지 다양하게 나타났다 (데이터 미제시). 형질전환 토마토에서 도입된 외래유전자 발현이 안정적이지 않고 시간이 경과함에 따라 그 발현 양이 변한 것은 PTGS 또는 TGS 현상 때문일 것이다.
후속연구
- 2003). 그러나 이러한 결과들은 형질전환체로 선발된 이후에 조사된 결과로서, 형질전환 초기 선발단계부터 silencing 이 진행된다면, 형질전환체의 선발도중에 항생제에 저항성을 잃어버리게 될 것이고, 따라서 형질전환체로 자라지 못할 것이다. 즉, 실제는 80% 보다 훨씬 높은 빈도로 외래유전자의 silencing이 일어날 수 있음을 추정할 수 있다.
- 이처럼 형질 전환연구에서 외래유전자의 silencing 현상은 아주 높은 빈도로 발생하고 있으며, 도입된 유전자의 안정적 발현을 예측할 수 없게 한다. 따라서 외래유전자가 도입되어 유전자의 발현이 안정적으로 되는 형질전환체를 확보하기 위해서는, 대량의 형질전환체를 생산하여 여러 세대를 거치면서 안정적인 유전자 발현을 보이는 line을 선발하거나, 외래유전자 발현의 silencing 현상을 연구하여 이를 조절할 수 있는 기술이 개발되어야 할 것이다.
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