초록 ▼

1. 당뇨특이 GAD65 epitope의 cloning 및 발현
(1) 췌장 소도세포 RNA 분리
(2) Primer 합성 및 RT-PCR
(3) PCR cloning 및 subcloning
(4) Overlapping GAD65 subclones의 배양 및 발현
(5) Overlapping GAD65 subclones의 정제
- GAD65-180 의 정제
- GAD65-S1의 정제
- GAD65-S2의 정제
- GAD65-S3 및 -D의 정제
2. 목표항원(G

1. 당뇨특이 GAD65 epitope의 cloning 및 발현
(1) 췌장 소도세포 RNA 분리
(2) Primer 합성 및 RT-PCR
(3) PCR cloning 및 subcloning
(4) Overlapping GAD65 subclones의 배양 및 발현
(5) Overlapping GAD65 subclones의 정제
- GAD65-180 의 정제
- GAD65-S1의 정제
- GAD65-S2의 정제
- GAD65-S3 및 -D의 정제
2. 목표항원(GAD65-S1)의 선정
(1) Direct ELISA
(2) IRMA (immunoradiometric assay) inhibition test
3. 고상 면역크로마토그래픽 조건
(1) 라텍스 감작
(2) 항체고정 latex의 안정화
(3) 항체 고정 membrane의 제조 및 안정화 조건
(4) 재조합 항원 고정 membrane의 제조 및 안정화 조건
4. 재조합 GAD 항원 (S1 fragment)의 대량생산
(1) S1 fragment 발현 벡타 제조 및 발현
(2) S1 fragment의 대량생산
- S1 fragment solubilization
- refolding 조건
- ion-exchange 및 affinity chromatography

Abstract ▼

1. Cloning and expression of GAD65-specific epitope
(1) Isolation of pancreatic islet RNA
(2) Primer synthesis and RT-PCR
(3) PCR cloning and subcloning
(4) Expression of overlapping GAD65 subclones
(5) Purification of overlapping GAD65 subclones
2. Determination of target an

1. Cloning and expression of GAD65-specific epitope
(1) Isolation of pancreatic islet RNA
(2) Primer synthesis and RT-PCR
(3) PCR cloning and subcloning
(4) Expression of overlapping GAD65 subclones
(5) Purification of overlapping GAD65 subclones
2. Determination of target antigen (GAD65-S1)
(1) Direct ELISA
(2) IRMA inhibition test
3. Solid-phase immunochromatography
(1) Sensitization of latex particles
(2) Stabilization of antibody-sensitized latex particles
(3) Preparation and stabilization of antibody immobilized membrane
(4) Preparation and stabilization of antigen immobilized membrane
4. Large-scale production of S1 fragment
(1) Construction and expression of GAD65-S1/pET
(2) Production of S1 fragment

목차 Contents

• 표지...1
• 제출문...2
• 요약문...3
• SUMMARY..14
• 목차...26
• 제1장 서론...30
• 제2장 국내외 기술개발 현황...33
• 제3장 연구개발 수행 내용 및 결과...34
• 제1절 실험 방법...34
• 1. 당뇨특이 epitope의 cloning 및 발현...34
• 가. 췌장소도세포 RNA 분리...34
• 나. Primers 합성 및 RT-PCR...35
• 다. PCR cloning 및 subcloning...35
• 라. Overlapping GAD65 subclones의 배양 및 발현...36
• 마. Overlapping GAD65 subclones의 정제...36
• (1) GAD65- 180의 정제...36
• (2) GAD65-S1, S2의 정제...37
• (3) GAD65- S3, D의 정제...38
• 2. 목표항원(GAD65-S1) 선정...38
• 가. Direct ELISA...38
• 나. IRMA inhibition test...39
• 3. 고상 면역크로마토 그래피 조건...39
• 가. 라텍스 감작...39
• 나. 항체감작 라텍스의 안정화 조건...39
• 다. 항체고정 membrane의 제조...40
• 라. 항체고정 membrane의 안정화조건...40
• 마. 재조합 항원고정 membrane의 안정화 조건...40
• 4. 재조합 GAD(S1 fragment)의 대량생산...41
• 가. S1 fragment 발현벡타 제조 및 발현...41
• 나. S1 fragment의 대량생산...41
• (1) S1 fragment 의 solubilization...41
• (2) Refolding 조건...41
• (3) Ion-exchange 및 affnity chromatography...42
• 5. GAD65-S1 재조합항원의 효능 실험...42
• 가. In vItro translation...42
• (1) T7 oriented S1 vector의 제조...42
• (2) In vitro translation...42
• 나. In vitro translated S1을 이용한 면역침강법...42
• 다. ELISA kit formulation...42
• (1) GST활성 측정...42
• (2) GST inhibition assay...43
• (3) Glutathione coated plate 이용한 ELISA...43
• (4) Protein-A coated plate 이용한 ELISA...43
• (5) Plain plate 이용한 ELISA...43
• 6. 진단키트 제작 및 전개조건...44
• 가. Lateral-flow 형태의 진단 strip 제작...44
• (1) Application piece 제조...44
• (2) Latex감작...44
• (3) Membrane 제조...44
• (4) Immunochromatography 전개...45
• 나. 혈청전개조건...45
• 7. GAD 자가항체 진단 strip의 효능 비교...46
• 제2절 결과 및 고찰...47
• 1. 당뇨특이 epitope의 cloning 및 발현...47
• 가. GAD65 특이 epitope의 cloning...47
• 나. Overlapping GAD65 subclones의 배양 및 발현...49
• (1) GAD65 subclones의 배양조건...49
• (2) GAD65 subclones의 발현...57
• 다. Overlapping GAD65 subclones의 정제...57
• (1) GAD65-180의 정제...57
• (2) GAD65-S1 의 정제...62
• (3) GAD65-S2 의 정제...62
• (4) GAD65-S3 및 D 의 정제...67
• 2. 목표 항원의 선정...72
• 가. Direct - ELISA를 이용한 overlapping GAD65 subclones 비교...72
• 나. IRMA inhibition assay...77
• 3. 고상 면역크로마토그래피...77
• 가. 항체 감작 latex 제조...77
• (1) Reaction bu ffer 선정...77
• (2) pH 효과...79
• (3) Blocking agent 선정...79
• 나. 항체감작 라텍스의 안정화 조건...81
• (1) Latex supension buffer(LSB)의 첨가제 검토...81
• (2)pH 효과...82
• 다. 항체 고정 menbrane 제조...82
• (1) 항체 고정 buffer 선정...83
• (2) Blocking reagent 선정...83
• 라. 항체고정 membrane의 안정화 조건...84
• (1) Stabilizer...84
• 마. 제조합 항원고정 membrane 제조 및 안정화...86
• (1) 재조합 항원고정 buffer 선정...86
• (2) Membrane 안정액 선정...87
• 4. 재조합항원 (GAD65-S1)의 대량생산...88
• 가. S1 fragment 발현 벡타제조 및 발현...88
• 나. S1 fragment 대량생산...88
• (1) S1 fragment solubilization...88
• (2) refolding 조건...91
• (3) Ion-exchange 및 affnity chormatography...91
• 5. GAD65-S1 제조합 항원의 효능 실험...95
• 가. In vitro translation 및 immunopercipitation...95
• 나. ELISA kit formulation...99
• (1) GST 활성 측정...99
• (2) Glutahione/Protein A coated plate를 이용한 ELISA...99
• (3) Plain plate를 이용한 ELISA...102
• (가) Blocking agent에 대한 반응성...102
• (나) GST/DH5 a E.coli lystate에 대한 반응성...102
• 6. 진단키트 제작 및 전개조건...102
• 가. 진단키트 제작...102
• 나. 혈청전개 조건...102
• (1) 전개 buffer의 detergent효과...105
• (2) 전개 buffer의 pH 효과...105
• 7. GAD 자가항체 진단 strip 의 효능비교...109
• 제4장 연구개발 목표 달성도 및 대외 기여도...111
• 제5장 연구결과의 활용계획...115
• 제6장 참고문헌...116
• <위탁 연구 결과>...121
• 제 1장 서론...121
• 제 2장 국내 외 기술개발 현황...124
• 제 3장 연구개발수행 내용 및 결과...125
• 1. 대상...125
• 2. 연구방법...125
• 제 4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도...135
• 제 5장 연구개발결과의 활용계획...135
• 제 6장 참고문헌...136