재조합 상피세포성장인자 정제원료(이하 rhEGF)의 체외활성 검정방법중 동물실험모델을 개발하였으며 상처부위의 조직학적 검사도 확립하였다. 또한 이러한 동물실험모델에 대하여 간편하고 정확한 유사분열활성측정법(mitogenic assay)를 개발하여 ED50 값을 측정하였을 때 $0.7{\sim}1.0ng/ml$로 대조물질로 사용한 생쥐 EGF(Sigma) 또는 국제표준품인 NIBSC 표준품보다 약간 높은 유사분얄 촉진활성을 나타내었다. 또한 A431세포를 이용한 수용체결합측정법의 개발에 있어서도 오차 10%이내의
재조합 상피세포성장인자 정제원료(이하 rhEGF)의 체외활성 검정방법중 동물실험모델을 개발하였으며 상처부위의 조직학적 검사도 확립하였다. 또한 이러한 동물실험모델에 대하여 간편하고 정확한 유사분열활성측정법(mitogenic assay)를 개발하여 ED50 값을 측정하였을 때 $0.7{\sim}1.0ng/ml$로 대조물질로 사용한 생쥐 EGF(Sigma) 또는 국제표준품인 NIBSC 표준품보다 약간 높은 유사분얄 촉진활성을 나타내었다. 또한 A431세포를 이용한 수용체결합측정법의 개발에 있어서도 오차 10%이내의 재현성을 나타내었고 HPLC방법과의 상관성도(1)(RBA)=0.99x(HPLC)+0.04, r=1.00로 계산되어 역가측정법으로 유효한 것으로 판단되었다. 생식독성연구에 필요한 약 4g의 원료를 fed-batch 발효법(20L-1회)에 의한 고농도 배양과 정제규모의 Scale-up을 통해서 2.5g/1회 이상의 순수한 단백질을 정제하였으며 의약품으로써의 기준시험을 실시 하였을때 순도 및 역가에서 우수함이 판명되었다. 생식독성시험중 랫드의 수태능 및 일반생식독성시험에서는 고용량군(1000μg 피하주사)에서 제중증가경향외에는 일반증상, 사료섭취량에 영향은 없었고 임신모체의 부검결과 간장과 흉선의 무게가 증가하는 경향을 보였으며 임신기간의 연장이 최고 용량 수여군에서 나타난 것외에 교배, 임신, 수유기에 미치는 영향은 없었다. 또한, 출산자, 태자의 내장기형, 외형기형, 골격기형, 차산자의 생식능에 미치는 영향도 특이한 사항이 없음을 확인하였다. 아울러, 랫드에 대한 최기형성 시험을 통하여 재조합 상피세포성장인자는 랫드에 대하여 최기형성이 없음을 알 수 있었다. 또한 각막부활제(DWP401 안연고) 및 피부재생제(DWP401 외용액제)에 대한 안정성 시험 방법을 확립하여 실시한 결과 각막부활제는 10개월, 피부재생제는 24개월의 안정성을 확보하였다. 한편, 임상시험의 첫단계인 건강한 성인남자를 대상으로 하여 의약품의 안전성 및 내약성을 확인하는 제1상 임상시험을 실시하였다. 각막부활제의 경우는 총 54명을 대상으로 단일투여 및 반복투여를 통하여 최대 500μg까지의 안전성을 확인하였으며 또한 약물 동력학적 분석 결과 각 용량군의 피험자에서의 눈물, 혈액, 소변중의 rhEGF농도를 대조군과 비교하였을 때 차이를 보이지 않았지만 다만 눈물 중에서 rhEGF가 검출됨을 알 수 있었다. 피부재생제의 경우 또한 총 32명을 대상으로 3가지 단계로 나누어 정상 및 상처 모델에서의 피부에 대한 안전성 및 내약성을 확인한 결과 최대 500μg/ml를 투여 하였을때 피부에 대해 자극이 없는 것으로 평가되었으며 약물동력학적 검사 결과 체내에 흡수되지 않거나 분해가 빠르게 되는 것을 나타나 앞으로 2상 진입을 통해 외용제로서의 효능을 평가하는 것이 필요한 것으로 사료되었다.
Abstract▼
The animal wound model and accompanied method of histopathological examination were established successfully. The mitogenic assay, newly developed easy and accurate method to calculate the biological activity of EGF, showed that the value of ED50 of the rhEGF was constantly 0.7-1.0 ng/ml, higher val
The animal wound model and accompanied method of histopathological examination were established successfully. The mitogenic assay, newly developed easy and accurate method to calculate the biological activity of EGF, showed that the value of ED50 of the rhEGF was constantly 0.7-1.0 ng/ml, higher value in stimulating mitosis than control mouse EGF Sigma o intrenational NIBSC standard. And receptor binding assay using A431 cell was also well established for the in vitro activity test on highly reproducible result that less than 10% of standard error and high correlation with the HPLC method. Total 4g of rhEGF, produced from several 20 liter scale of fed-batch fermentation, was proved to possess enough purity and activity in a view of therapeutic drug guidelines. In reproductive toxicity study tested in rats, rhEGF induced to harmful changes in food consumption, mating, pregancy, post-natal period and other general symptom of the rats in spite of appearing tendency of slight weight gain, liver and thymus expansion, and prologed period of pregnancy. Besides, the-experiment to perform teratogenecity test in the rat also induced no harmful changes. On the other hand, the staility test methods was established and we found that ophthalmic ointment is stable for 10 months and dermal solution is stable for 24 months. Phase I clinical trials was conducted to confirm safety and drug tolerance with healthy volunteers. On ophthalmic ointment, we confirmed the safety to 500μg through single rising dose tolerance and multiful rising dose tolerance in 54 healthy volunteers. Through pharmacokinetic analysis, we compared the concentration of rhEGF between placebo group and applied group on tears, blood and urine and found that there was no deference on the concentration of rhEGF between two groups but only rhEGF was detected in the tears. In the case of Dermal solution, we confirm that there is no irritation on skin with the maximum dosage of 500μg through three kinds of steps between normal and wound models. Through pharmacokinetic analysis of blood and urine, we couldn't find a significant difference between treated and control group, so we conclude that rhEGF is not absorbed into the body or is metabolized quickly. From above study, we suppose that it is necessary to evaluate the efficacy as dermal solution through Phase II clinical trials.
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