초록 ▼

제 1차년도 (1995)의 연구목표는 BCG에서 항암 기전을 나타나게 하는 구성 성분을 파악하는 데 있으며 이를 위하여 BCG를 대량으로 배양하는 기술을 개발하였고 대량으로 배양하여 수거한 후 동결건조시킨 균체를 이용하여 이를 다단계로 초음파 마쇄하고 원심분리하는 방법을 사용하여 BCG를 7가지의 세포벽 (fraction 1, 2, 3) 및 세포내 분획 (fraction 4, 5, 6, 7)으로 추출하였고 각각의 분획을 200-700nm에서 흡광도를 비교한 결과 fraction 1, 2, 3과 fraction 4, 5, 6, 7은

제 1차년도 (1995)의 연구목표는 BCG에서 항암 기전을 나타나게 하는 구성 성분을 파악하는 데 있으며 이를 위하여 BCG를 대량으로 배양하는 기술을 개발하였고 대량으로 배양하여 수거한 후 동결건조시킨 균체를 이용하여 이를 다단계로 초음파 마쇄하고 원심분리하는 방법을 사용하여 BCG를 7가지의 세포벽 (fraction 1, 2, 3) 및 세포내 분획 (fraction 4, 5, 6, 7)으로 추출하였고 각각의 분획을 200-700nm에서 흡광도를 비교한 결과 fraction 1, 2, 3과 fraction 4, 5, 6, 7은 구성물질이 서로 유사할 것으로 판단되었다. 제 1차년도에는 BCG에서 항암 기전을 나타내게 하는 구성 성분을 파악하기 위하여 BCG에서 추출된 7가지의 BCG 분획에 의한 생쥐 비장세포와 복강내 삼출세포에서 LAK과 자연살 세포의 활성도, 암세포매개성 살해능의 변화 및 CD3, CD4, CD8 및 CD25 등의 T세포 아형의 변화를 관찰하였다. 연구결과 BCG 세포벽 성분이 많이 함유된 fraction 1, 2 및 3 에 의하여 LAK과 자연살 세포의 활성도, 암세포매개성 살해능 및 비장세포와 복강삼출세포에서의 CD4의 비율 등이 BCG와 유사하게 증가되었다. 따라서 BCG의 면역작용이 세포벽 성분에 의한 것임을 추정할 수 있었다.
BCG의 세포벽 구조는 특이하고 PGL(phenolic glycolipid), GPL(glycopeptidolipid)과 LPS(lipo-polysaccharide) 등의 다량의 지방질 복합체를 함유하고 있는 것으로 알려져 있으나 수용액 분획으로 용해된 세포벽의 성분은 LPS일 것으로 추정되어 있는 LPS에 의한 것임으로 추정되어 제 2차년도인 1996년의 연구 목표를 이 LPS에 의한 면역 활성효과를 BCG와 비교하여, BCG의 면역활성 기전을 분자생물학적으로 규명하는데 두었다.
제 2차년도(1996)의 연구목표는 BCG의 세포막에서 지방질 복합체인 lipopolyscccharide(LPS)를 phenol을 이용하여 추출하고 확인하며(제 1세부과제), 이 BCG phenol extract에 의한 생체내 면역 활성 기전을 파악하고 이를 BCG와 비교하고 (제 3세부과제), 기초실험인 BCG에 의한 면역 활성기전의 분자생물학적 규명(제 2세부과제)과 동물실험 모델에서 방광암을 유발하여 제 3차년도 연구를 위한 가장 적절한 방광암 유발조건을 수립하는데 두었다(제 4세부과제).
제1세부과제에서는 BCG 세포벽 성분에서 phenol을 이용하여 LPS가 다량 포함되어 있는 유용성분을 추출하였다. 대한결핵협회 결핵연구원에서 분양받은 Mycobacterium bovis BCG (French strain 1173P2)를 Micclebrock 7H9 broth를 사용하여 배양한 후 원심분리하여 균체만을 회수한 다음 동결 건조시켜 사용하였다. BCG의 LPS 성분 추출 및 정제를 위하여 동결 건조된 상태의 BCG에서 phenol을 이용하여 BSLB/C mouse로부터 얻은 splenocyte에 각각의 성분을 처리하여 proliferation되는 정도를 비교하였다. BCG phenol extract는 생균 BCG와 유사하게 splenocyte를 proliferation 시키는 능력을 보였다. 또 사람에서 유래한 대식세포주인 THP-1을 대상으로 proliferation 실험을 수행했을 때는 생균 BCG가 가장 좋은 결과를 보였고 가열한 BCG와 BCG Phenol exract는 비슷한 경향을 보였다.
제2세부과제에서는 BCG의 면역활성기전을 분자생물학적으로 규명하였다. 인체 단핵세포/대식 세포주인 THP-1 세포주에 생균 BCG 감염시키고 differential display reverse transcripatase polymerase chain reaction (DD RT-PCR)에 의한 특이 유전자를 선별하였다. 대조군과 BCG 감염군의 세포로부터 각각 mRNA를 추출하고, 추출한 mRNA를 대상으로 80여종의 primer와 oligo dT를 사용하여 RT-DD-PCR에 의해 증폭시켰다. 반응이 끝난 다음 sequencing gel에서 전개시켜 대조군에서는 나타나지 않은 차별화된 band를 200개 얻었고 이들 중 PCR에서 재현성을 보이는 186개의 band를 대상으로 Nothern blotting을 실시하여 최종적으로 발현정도에서 차이를 보이는 4개의 클론을 얻었다. 이 4개의 클론의 염기서열을 결정하고 GeneBank에 수록된 자료와 비교한 결과 그 중 하나의 클론이 human ferritin heavy chain과 일치하는 것임을 밝혀내었고 나머지 클론들을 규명하는 작업을 계획 중이다.
제 3세부과제에서는 1세부과제에서 생산된 BCG phenol extract에 의한 생체 내에서의 면역반응을 검토하고 이를 BCG와 비교하였다. BCG 및 BCG phenol extract를 실험동물의 방광내 여러 기간 동안 투여 후 방광점막내 T세포 아형의 분포 변화를 관찰하였다. 실험동물은 대한 실험동물 주식회사에서 공급 받은 순계 암컷 SD rat을 사용하였고 BCG는 1mg/0.2ml로, 제 1세부과제에서 추출한 BCG phenol extract는 10μg/0.2ml로 PBS에 회석하여 방광내로 정해진 스케쥴에 따라 주입한 후 방광을 적출하였다. T 세포아형의 변화는 동결절편에서 면역조직화학염색으로 관찰하였다. 방광 점막내 T 세포 아형의 변화를 관찰한 결과 BCG phenol extract에 의하여도 방광내에서 특징적인 BCG 반응인 보조 T 세포의 침윤이 유의하게 대조군에 비하여 증가하여 생체내에서 이 phenol 추출물에 의한 반응이 BCG와 유사한 것을 파악할 수 있었다.
제 4세부과제에서는 차년도의 유효성분의 항암능 판정을 위한 예비 실험으로 방광암의 발암제인 BBN 투여 후 방광암 발암모델을 설정하였다. 순계 숫컷 SPF SD rat을 사용하여 0.05% BBN을 투여한 결과 8주 투여군에서는 33%에서 이행상피 과증식의 소견이, 16주 투여군에서는 이행상피 과증식과 함께 25%에서 이행상피 유두종의 소견이, 24주 투여군에서는 이행상피 과증식, 유두종과 함께 33%에서 이행상피암의 소견을 보였다. 본 실험 결과 12주 투여가 가장 적절한 발암조건임을 파악하였다.
제 3차년도(1997)의 연구목표는 BCG phenol extract를 생산하여 제 3세부과제의 연구재료로 제공하며 BCG phenol extract의 구조를 분석하며(제 1세부과제), 이 BCG phenol extract에 의한 발암동물에서 발암억제능을 관찰하고 이를 BCG와 비교하고(제 3세부과제), BCG phenol extract 의 시험관내 및 생체내 면역 활성기전과 BCG의 항암효과 규명작업의 일환으로 BCG에 의한 면역활성기전의 세포생물학적 규명에 있다(제 2세부과제).
제 1세부과제에서는 대량으로 배양한 BCG 중 일부에서는 전년도와 같은 방법으로 BCG 세포벽 성분에서 phenol을 이용하여 LPS가 다량 포함되어 있는 유용성분을 추출하였다. BCG는 대한결핵협회 결핵연구원에서 분양받은 Mycobacterium bovis BCG(French strain 1173P2)를 Micclebrock 7H9 broth를 사용하여 배양한 것을 사용하였다. 다른 일부에서는 BCG phenol extract에서 불순물을 제거하고, 수확율을 높이기 위해 추출방법을 변형하여 추출하였고 각각의 추출물을 분석하기 위하여 infrared spectrophotometry로 200-700nm의 빛에서 흡광도를 관찰하였고 대장균에서 얻은 LPS와 비교하였다. BCG phenol extract A에서 대장균의 LPS와 흡광 pattern이 유사하였으나 280nm 부근에서 강흡수를 보이는 불순물이 있음을 알수 있었고 앞으로 불순물 제거를 위한 연구가 필요할 것으로 생각되었다.
제 2세부과제에서는 1세부과제에서 생산된 BCG phenol extract에 의한 시험관내 및 생체 내에서의 면역반응을 검토하고 이를. BCG와 비교하였다. BCG 및 BCG phenol extract를 실험동물의 방광내 투여 후 방광점막에서 tumor necrosis factor-α(TNF-α), interferon-v (INF-v), interleukin-2(IL-2) 등의 cytokine 발현을 관찰하였다. 실험동물은 대한 실험동물주식회사에서 공급 받은 순계 암컷 SD rat을 사용하였고 BCG는 1mg을 BCG phenol extract는 10μg을 정해진 스케쥴에 따라 방광내로 주입한 후 방광을 적출하였고 cytokine의 발현은 RT-PCR법으로 관찰하였다. 시험관내에서는 사람 대식세포주인 THP-1 세포주에 BCG를 감작시킨후 INF-v interleukin-1 (IL-1), interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor-α(TNF-α) 등의 cytokine의 발현 변화를 RT-PCR법으로 관찰하였다. 실험동물의 방광에서는 INF-v와 TNF-α의 발현이 증가됨이, 사람 대식세포주인 THP-1 세포주에서는 BCG를 감작시킨후 IL-1과 IL-6의 발현이 증가됨이 관찰되었다. 방광내에서 BCG phenol extract의 면역활성이 BCG와 유사한 것을 파악할 수 있었다. 또 BCG의 면역활성기전을 세포생물학적으로 규명하기 위하여 BCG에 의한 수지상세포 (dendritic cells: DC)의 활성을 관찰하였다. 먼저 단기배양을 통해 인체말초혈액단핵세포로부터 DC를 정제하고 수지상세포의 표면항원발현의 특성을 파악하였고 BCG 처리로 DC가 성숙되어 BCG에 의한 일반적인 면역자극효과가 DC의 활성화에 관계될 것으로 생각되었다.
제 3세부과제에서는 1세부과제에서 생산된 BCG phenol extract와 BCG를 BBN으로 방광암을 유도한 실험동물의 방광암에 투여하고 항암효과를 관찰하였다. BCG 투여군과 유사하게 BCG phenol extract 투여군에서도 대조군에 비하여 육안적 및 현미경적으로 방광암의 발생이 억제되었으나 통계적 유의성은 찾지를 못하였다.

Abstract ▼

Bacillus Calmette-Guerin is the drug of choice intravesical therapy for preventing recurrence and progression in superficial bladder tumor, but has severe side effect. We investigated antitumor components in bacillus Calmette-Guerin(BCG) to reduce the adverse effect of intravesical BCG therapy for p

Bacillus Calmette-Guerin is the drug of choice intravesical therapy for preventing recurrence and progression in superficial bladder tumor, but has severe side effect. We investigated antitumor components in bacillus Calmette-Guerin(BCG) to reduce the adverse effect of intravesical BCG therapy for prevention of recurrence and progression in superficial bladder tumor. In first year of study period, we extracted cell wall and intracytoplasmic components from BCG and compared change of cellular immune response and macrophage activation with whole BCG and analysed effect of each components to find the components which showed similar immune response with whole BCG. Seven fractions were collected by multiple ultrasonification and centrifugation of BCG solution and the difference of each fraction was confirmed by spectrophotometric absorbance. Change of lymphokine killer(LAK), natural killer(NK) cell activity and tumor cell dependent cytotoxic activity of mouse spleen cells and proportion of T cell subset(CD4, CD8, CD25) in mouse spleen and peritoneal lymhocytes were investigated and we found similar results in fraction 1, 2 and 3 (cell wall component) compared with whole BCG. In second year period of study, we extracted LPS rich component from BCG cell wall (BCG phenol extract) and this component showed splenocytes from BALB/C mouse and THP-1 cells proliferative activity. In animal experiment, distribution of T cell subset identified by immunohistochemical staining, especially increased helper T cells in urinary bladder mucosal tissue was documented by BCG phenol extract. This was similar result compared with whole BCG. In third year of study, we investigated cytokine expression in urinary bladder tissue after serial instillation of BCG phenol extract and whole BCG. Expressions of tumor necrosis factor-$\alpha$ and interferon-$\gamma$ was identified by RT-PCR in urinary bladder treated with BCG phenol extract. This results were simlar with experimental results by whole BCG. We thought that the immune activation of BCG phenol extract were similar with whole BCG. In third year, we investigated antitumor effect of BCG phenol extract in BBN induced experimental bladder tumor and compared with BCG. BCG phenol extract showed same effect with BCG in tumor development and number, size, cellular grade and stage of developed tumor.

목차 Contents

• 제 1 장 서론...11
• 제 1 절 국내외 연구개발현황...11
• 제 2 절 현 기술상태의 문제점 및 앞으로의 전망...12
• 제 3 절 연구개발의 중요성...14
• 제 4 절 지금까지의 연구개발실적...16
• 제 2 장 연구개발목표...20
• 제 1 절 연구개발의 최종목표...20
• 제 2 절 구체적 연구개발목표...20
• 제 3 절 연차별 연구개발목표...21
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과...22
• 제 1 절 제1차년도(1995년) 연구개발수행내용 및 결과...23
• 제 2 절 제2차년도(1996년) 연구개발수험내용 및 결과...48
• 제 3 절 제3차년도(1997년) 연구개발수험내용 및 결과...84
• 제 4 장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도...124
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획...127
• 제 6 장 참고문헌...129