보고서 정보
주관연구기관 |
식품의약품안전평가원 National Institute of Food and Drug Safety Evaluation |
연구책임자 |
정자영
|
참여연구자 |
강현경
,
김재옥
,
박상진
,
김병국
,
최찬웅
,
권은정
|
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2016-12 |
과제시작연도 |
2016 |
주관부처 |
식품의약품안전처 Ministry of Food and Drug Safety |
등록번호 |
TRKO201700017575 |
과제고유번호 |
1475009365 |
사업명 |
의약품등안전관리 |
DB 구축일자 |
2017-11-25
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키워드 |
비씨지.백신.역가.유세포분석기.BCG.Vaccine.Potency.FACS.
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DOI |
https://doi.org/10.23000/TRKO201700017575 |
초록
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□ 연구개발의 목적 및 필요성
현재 BCG 백신의 역가시험으로 사용하고 있는 생균수 측정시험법은 백신을 적절한 농도로 단계 희석하여 배양배지에서 배양한 후 균의 수를 산정하는 CFU(Colony Forming Unit)법이 사용되고 있다. 이 방법은 균주의 배양기간이 4∼5주 소요되어 제조 단계별로 장기간이 소요되고, 배양 균액의 단계 희석에 따른 오차, 배양중 배지 변형으로 인한 측정값의 편차 및 mycobacteria의 clumping 경향에 따른 계수 오차 등이 발생하는 단점이 있다. 이에 ATP assay, tetera
□ 연구개발의 목적 및 필요성
현재 BCG 백신의 역가시험으로 사용하고 있는 생균수 측정시험법은 백신을 적절한 농도로 단계 희석하여 배양배지에서 배양한 후 균의 수를 산정하는 CFU(Colony Forming Unit)법이 사용되고 있다. 이 방법은 균주의 배양기간이 4∼5주 소요되어 제조 단계별로 장기간이 소요되고, 배양 균액의 단계 희석에 따른 오차, 배양중 배지 변형으로 인한 측정값의 편차 및 mycobacteria의 clumping 경향에 따른 계수 오차 등이 발생하는 단점이 있다. 이에 ATP assay, teterazolium salt(XTT) assay 등 다양한 새로운 시험법의 개발이 시도되고 있으나 ATP를 추출하는 방법에 따른 차이, 세포증식에 비례하여 형성되는 formazan 형성의 오차로 인한 부정확성 등의 단점으로 인해 아직 실용화 단계에 도달하지는 못한 실정이다. 이러한 상황에서 세균의 생존율(Viability rate)을 측정하는데 매우 정확하고 민감하다고 알려져 있으며 세균을 배양하는 시간이 필요하지 않아 신속한 분석이 가능한 유세포분석기(Flow cytometry, FACS)를 이용하여 BCG 백신의 생균수 측정을 위해 자동화기기를 이용한 새로운 시험법을 개발하고자 한다.
□ 연구개발의 내용 및 범위
○ 유세포분석기를 이용한 생균수 측정 시험법 적용가능성 연구
○ 개발 시험법의 밸리데이션 및 기존시험법(CFU법)과의 상관성 비교 연구
○ 유세포분석기를 이용한 생균수 측정 시험법 확립
□ 연구개발 결과 요약
본 연구에서는 유세포분석기를 이용한 BCG 백신의 생균수 측정 시험법 적용가능성에 대해 연구하였다.
먼저 적용 가능한 형광 염색물질로 fluorescein diacetate(FDA)를 선정하여 FACS 시험법을 개발하였으며 시험법 확립을 위해 특이성, 직선성, 정밀성의 밸리데이션을 수행하였다. 그 결과, 멸균처리하여 사균을 유도한 dead 균과 비교하여 아무 처리하지 않은 live 균에 대해 특이적으로 검출되는 것을 확인하였으며,보관온도 변화를 통해 인위적으로 BCG 백신의 생균수를 감소시켰을 때 온도가 높을수록 FACS법과 CFU법에서 생균수가 감소되는 것을 확인함으로써 직선성을 검증하였다. FACS법의 정밀성 검증을 위해 일내, 일간, 실험자간, 로트별 분석을 실시하였으며 CV값이 모두 5% 이하로 비교적 정확한 결과값을 나타내는 것을 확인하였다. 다음으로 FACS법과 CFU법의 상관성 분석을 위해 생균의 비율(%)인 FACS의 결과값을 입도분석기로 측정한 BCG 백신의 총균수에 적용하여 FACS법의 생균수를 계산하여 비교 분석하였다. 그 결과 로트별 생균수 측정에 대한 FACS법의 CV값은 모두 5% 이하인 반면 CFU법은 7.49∼34.67%로 높은 편차를 보여 FACS법이 더 신뢰할 수 있는 결과임을 확인하였다. 두 시험법에 대한 피어슨상관계수는 경피용 BCG 백신 0.4076, 피내용 BCG 백신 0.7428로 모두 양의 상관관계를 보여 CFU법의 결과값이 증가하면 FACS법의 결과값도 증가하는 것으로 확인되었다. 추가적으로 BCG 백신 개발업체 및 연구기관과의 공동연구를 통해 FACS법 및 CFU법에 대한 기관 간 상관성을 비교 분석하였다.
그 결과 FACS법에 대한 세 기관의 피어슨상관계수는 0.8729∼0.9810으로 세 기관 간에 높은 양의 상관관계가 확인되었고, FACS법과 CFU법에 대한 기관 간 피어슨상관계수는 경피용 BCG 백신 0.6962, 피내용 BCG 백신 0.7428로 CFU법의 결과값이 증가하면 FACS법의 결과값도 증가하는 것으로 확인되었다. 로트별 BCG 백신에 대한 FACS법의 기관간 CV값이 최고 7.81%인 반면 CFU법의 경우 9.60∼95.49%로 높은 편차를 보여 마찬가지로 FACS법이 더 신뢰할 수 있는 결과임을 확인하였다.
결론적으로 본 연구를 통해 신속하고 간편하며, 실험간 편차를 최소화 할 수 있는 BCG 백신의 생균수 측정을 위한 유세포분석기 기반의 새로운 시험법을 개발하였으며, 향후 관련 업계 등에 확립된 시험법을 제공함으로써 BCG 백신의 품질관리 향상에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
( 출처 : 요약문 3p )
Abstract
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□ Objective
The current standard method for determination of number of viable units in a BCG vaccine is based on counting the number of colony forming unit (CFU) produced after cultivation, in which serial dilutions of vaccine are prepared and cultured in badges. But cultivation is time-consuming
□ Objective
The current standard method for determination of number of viable units in a BCG vaccine is based on counting the number of colony forming unit (CFU) produced after cultivation, in which serial dilutions of vaccine are prepared and cultured in badges. But cultivation is time-consuming and slow growth of the cells takes up to 4∼5weeks. In addition, this method may give variable results due to different factors such as errors in serial dilutions, variation of estimation due to badge contamination during cultivation and their tendency to clump. Among the alternative methods for estimation of viable mycobacteria cells are ATP assay and teterazolium salt (XTT) assay, which have not yet put into practical use due to a number of difficulties and limitations. Flow cytometry(FACS) is by far the most sophisticated and reliable method to quantify variable cells and can measure the sizes and quantity of up to 1000 cells per second. FACS is an effective technique for the rapid analysis of cells without the need to grow mycobacteria. This study focused on improvement of BCG vaccine viability test method using automative equipment, FACS.
□ Contents
○ Study on applicability of viability test method using flow cytometry
○ Validation of the improved testing method and correlation study with CFU
○ Development of viability test method using flow cytometry
□ Results
In this study, we investigated the applicability of the BCG vaccine live cell count assay using flow cytometry. First, fluorescein diacetate (FDA) was selected as the applicable fluorescent dye material and FACS test method was developed. In order to establish the testing method, validation is conducted to identify the specificity, linearity and precision. When dyed BCG vaccines with FDA and measured by FACS, live bacterias were measured by specific compared with dead bacterias(heat-treated at 121℃). The linearity via inhibition of viability of BCG vaccine dependant on incubation temperature was identified by FACS and CFU methods. The values of coefficient of variation (CV) on intra, inter and intermediate precision using FACS were all less than 5%. Next, for the correlation analysis between the FACS and CFU methods, the result of FACS (%) was compared with the total number of BCG vaccine measured by coulter counter. As a result. the CV value of the FACS method were all less than 5%, whether CFU method was 7.49∼34.67%. The pearson correlation coefficient for both test methods were 0.4076 (intradermal) and 0.7757(percutaneous), a positive correlation between two methods as FACS value increased with increasing CFU value. Moreover, we conducted the collaboration between BCG vaccine producers and research institutes. As a result, the pearson correlation coefficient(r) of between the three institutions on FACS method were 0.8729∼0.9810, indicating that high positive correlation. And the pearson correlation coefficient of between the institutions for FACS and CFU methods were 0.6962(intradermal) and 0.742 (percutaneous), a positive correlation between two methods as CFU values and FACS values increase together. The CV value between the institutions of the FACS method for BCG vaccine was 1.13∼7.81%, while the CFU method showed a high CV value of 9.60∼95.49%, confirming that the FACS method was more reliable. In conclusion, this study has developed a new test method based on FACS for measuring the number of viable cells of BCG vaccine, which is quick and simple and minimizes the deviation between experiments. The results of this study will contribute to the improvement of the potency determination for BCG vaccine.
( 출처 : SUMMARY 4p )
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 자체연구개발과제 최종보고서 ... 2
- 국문 요약문 ... 3
- Summary ... 4
- 목차 ... 5
- 제1장 연구개발과제의 개요 ... 6
- 제1절 연구개발과제의 목표 ... 6
- 제2절 연구개발과제의 필요성 ... 6
- 제2장 연구개발과제의 국내·외 연구개발 현황 ... 9
- 제3장 연구개발과제의 연구수행 내용 및 결과 ... 10
- 제1절 FACS 형광 염색시약 선정 ... 11
- 제2절 FACS 시험법 개발 ... 20
- 제3절 개발 FACS 시험법과 기존시험법(CFU) 비교 및 상관성 분석 ... 34
- 제4장 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 60
- 제5장 연구개발과제의 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 63
- 제6장 연구개발과제의 연구개발 결과 활용계획 ... 64
- 제1절 활용성과 ... 64
- 제2절 활용계획 ... 64
- 제7장 참고문헌 ... 65
- 제8장 첨부서류 ... 67
- 끝페이지 ... 71
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