[국가R&D연구보고서]Antibody phage display library를 이용한 B형 간염 바이러스 표면 항원에 대한 마우스 단쇄 가변영역 항체의 생산 Production of mouse single chain Fv antibody to surface proteins of hepatitis B virus using antibody phage display library원문보기
본 연구는 항체발현 파지기법(antibody phage display library)을이용하여, B형 간염 바이러스 표면항원인 preS1과 preS2에 대한 마우스 단쇄가변영역 항체(single chain variable fragment, scFv)를 제작하여 그 염기서열을 규명하는 것을 목표로 하였다.우선 Balb/c 마우스를 각각 preS1과 preS2로 면역한 뒤 비장세포를 얻어 RT-PCR 기법으로 중사슬과 경사슬의 가변영역 cDNA를 얻었다. Recombinant PCR을 시행하여 두 가변영역 cDNA를 (G4S)3
본 연구는 항체발현 파지기법(antibody phage display library)을이용하여, B형 간염 바이러스 표면항원인 preS1과 preS2에 대한 마우스 단쇄가변영역 항체(single chain variable fragment, scFv)를 제작하여 그 염기서열을 규명하는 것을 목표로 하였다.우선 Balb/c 마우스를 각각 preS1과 preS2로 면역한 뒤 비장세포를 얻어 RT-PCR 기법으로 중사슬과 경사슬의 가변영역 cDNA를 얻었다. Recombinant PCR을 시행하여 두 가변영역 cDNA를 (G4S)3 linker로 연결하여 single chain Fv DNA를 얻었다. Sfi 1과 Not 1의 처리로 양끝이 절단된 scFv DNA를 pCANTAB 5E phagemid vector에 ligation시킨 후,E.coli XL1-Blue에 transfection시켜 scFv-library를 제작하였다. PreS1에 대한 library의 크기는 1 x 106pfu이었고, preS2에 대해서는 7 x 106pfu이었다. M13KO7 helper phage로library를 phage antibody(phabs) 형태로 rescue한 후 preS1과 preS2가 부착된 96 wellmicrotitre plate에서 3회에 걸쳐 panning을 시행하였다. 각 panning단계에서 확보된phagemid 콜로니로부터 phage antibody를 회수한 후 preS1과 preS2에대한 ELISA 검색을실시하여 항원과 결합하는 phabs를 얻었다. PreS1에 대한 phabs의 경우 총 7개의 항체클론이 양성반응을 보였고, preS2의 경우 4개의 항체클론이 비교적 높은 양성반응을 보였다.ELISA에서 가장 높은 반응을 보인 preS1 특이 pMsc-17 클론과 preS2-특이 pMsc-23클론 유래의 phabs를 각각 PEG로 침전시켜 농축시킨 후, 각각 GST, GST-preS1 fusionprotein, preS1과 GST, GST-preS2, preS2에 대한 ELISA를 다시 시행하여 그 특이 정도를확인한 결과, 위의 두 항체클론은 preS1과 preS2에 각각 특이적으로 결합하였다. 또한 두클론의 phabs를 non-suppressor 균주인 HB2151에 transfection시키고, 1 mM IPTG로induction하여 수용성 단쇄가변영역 항체를 발현시켰을 때 배양액내로 분비되지는 않았지만periplasmic space내에 축적되었다. 또한 pMsc-17 유래의 증폭된 phabs와 pMsc-23 유래의 수용성 항체로 각각 preS1에 대한 Western blot과 preS2에 대한 competitive ELISA를시행하여 이들 항체 클론들이 preS1과 preS2에 대한 특이 항체들임을 확인하였다. 이들 항체유전자의 염기서열을 결정한 결과, pMsc-17의 경사슬은 300bp의 크기로 Kabat antibodysequence data의 subgroup IIIC에 속하였고, pMsc-23의 중사슬은 348bp로 subgroup IB에속하였다.
Abstract▼
In this study, we are to produce the single chain variablefragment(scFv) antibodies against surface proteins of hepatitis B virus(HBV), preS1 andpreS2, using antibody phage display library, and to determine their DNA sequences.Balb/c mice were immunized with preS1 and preS2, respectively, an
In this study, we are to produce the single chain variablefragment(scFv) antibodies against surface proteins of hepatitis B virus(HBV), preS1 andpreS2, using antibody phage display library, and to determine their DNA sequences.Balb/c mice were immunized with preS1 and preS2, respectively, and cDNAs ofheavy and light chains of splenic B cells from immunized mice were prepared usingRT-PCR. Two cDNA were linked with (G4S)3 linker under recombination PCR toproduce single chain Fv DNA. After digestion of scFv DNA with Sfi 1 and Not 1, thedigested DNA was ligated into pCANTAB 5E and electroporated into E.coli XL1-Blue toprepare scFv-library. The size of library against preS1 was 1×106 pfu, and againstpreS2 was 7×106 pfu. Phage antibodies(phabs) against preS1 and preS2 were rescuedfrom their libraries with M13K07 helper phages, and preS1 or preS2-binders wereselected through 3 times of panning, against preS1/preS2 in 96 well microtitre plates.Phage antibody clones were assayed directly for the ability to bind preS1/preS2 byELISA. And then 7 phage antibody clones had high ELISA signal against preS1 and 4clones against preS2.Phage antibodies from preS1-specific pMsc-17 and preS2-specific pMsc-23 had thestrongest ELISA signal to preS1 and preS2, respectively. To prepare the soluble scFvantibody, phabs from each clone were transfected into non-suppressor E.coli HB2151,and grown under 1 mM IPTG. Soluble scFv antibodies were accumulated in theperiplasmic space. Phage antibody from pMsc-17 and soluble scFv antibody frompMsc-23 were used for Western blot to preS1 and competitive ELISA to preS2,respectively, and the results revealed they were specific antibodies to preS1 and preS2,respectively. We determined the DNA sequences of pMsc-17 and pMsc-23. The sizeof light chain from pMsc-17 was 300 bp and belonged to subgroup IIIC in Kabatantibody sequence data, and heavy chain from pMsc-23 was 348bp and to subgroup IB.
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