초록 ▼

분자생물학의 발달과 이용은 인체유전학 분야 이외에도 종양학전반에 걸친 분야에 많은 진보를 가져오게 하여 암의 발생에 관여하는 유전자들과(oncogenes and tumor suppressor genes) 암세포에 대항하는 면역반응에 관여하는 유전자들 (cytokine genes and co-stimulatory genes)이 규명되어 암이 다양한 방법의 유전자요법을 응용하여 치료될 수 있는 질병이라는 근거가 제시되었다. 지금까지의 대부분 암 치료를 목적으로 한 유전자 요법은 interleukin-2 (IL-

분자생물학의 발달과 이용은 인체유전학 분야 이외에도 종양학전반에 걸친 분야에 많은 진보를 가져오게 하여 암의 발생에 관여하는 유전자들과(oncogenes and tumor suppressor genes) 암세포에 대항하는 면역반응에 관여하는 유전자들 (cytokine genes and co-stimulatory genes)이 규명되어 암이 다양한 방법의 유전자요법을 응용하여 치료될 수 있는 질병이라는 근거가 제시되었다. 지금까지의 대부분 암 치료를 목적으로 한 유전자 요법은 interleukin-2 (IL-2)와 같은 여러 종류의 cytokine 유전자의cDNA를 이용한 면역 유전자치료 방법이 있으며, p53의 돌연변이가 관찰되는 암의 경우는정상적인 p53 유전자의 도입을 통해 암세포의 apoptosis를 유도하는 방법이 사용되고 있다.또 하나의 효과적인 암의 유전자 치료방법으로는 Herpes simplex virus의 thymidinekinase gene (HSV tk)을 사용하는 것이다. HSV tk gene은 bacterial cytosine deaminasegene과 같이 대표적인 drug susceptibility(suicide) gene으로, HSV tk 유전자의 산물의 경우 guanosine analogue인 ganciclovir(GCV)를 DNA 합성을 중단시킬 수 있는 intermediate로 전환시켜 cell death를 유도한다.본 연구에서는 국내에서 빈번히 나타나는 간암을 대상으로 한 가지 치료유전자의 도입을 통한 유전자치료가 아니라 면역 유전자요법에서 가장 많이 사용되고 있는 IL-2 유전자와 suicide gene therapy에 가장 많이 사용되는 HSV-tk 유전자를 동시에 도입 발현시켜 암세포 제거 효율을 극대화시킬 수 있는 병합 유전자치료 (combination gene therapy)의 모델을 정립하고자 하였다.IL-2 유전자와 HSV-tk 유전자가 도입되어 selection marker Neor gene과 함께 세 유전를 동시에 발현할 수 있는 재조합 레트로바이러스벡터 (LNC/IL2/IRES/TK)와 tk 유전자와 Neor 유전자만을 발현하는 LNC/IRES/TK를 제조하여 생쥐의 간암세포주인 BNL 1MEA.7R.1 (ATCC TIB-75:이 후 TIB-75 세포라 표기함) 세포주에 transduction 시키고 G418으로 선별 배양한 뒤, 각기 5개의 colony를 선택 확장 배양하여 IL-2를 측정한 결과(LNC-IL2/IRES/TK) 9,000 - 12,000 pg/106 cells/24h의 높은 생산율을 나타내었다. 또한이 세포주들을 gancicolovir로 처리하면 99% 이상의 세포가 72시간 이내에 사멸될 뿐 아니라, LNC/IL2/IRES/TK 바이러스로 감염되지 않은 TIB-75 세포와 혼합 배양하면 HSV-tk유전자가 발현하지 않는 세포의 사멸효과도 보여주는 bystander effect도 관찰되어, 위의 재조합 레트로바이러스가 combinational gene therapy에 효과적으로 이용될 수 있음을 시사해주었다. 이를 근거로 TIB-75를 생쥐에 피하 주사하여 종양조직을 형성시킨 뒤, 재조합 레트로바이러스를 생산하는 packaging 세포주를 암조직 내로 주입시켜 종양조직의 사멸효과를 관찰한 결과 HSV-tk 또는 IL-2 단독에 의한 효과보다는 IL-2와 HSV-tk가 동시에 작용하였을 때 가장 좋은 효과를 보였다. 또한 각 재조합 바이러스의 systemic antitumoralimmunity를 조사하기 위해 시행한 challenge inoculation 실험에서도 IL-2와 HSV-tk가 동시에 발현되는 암세포 (TIB-75/IL2/TK)가 가장 좋은 효과를 나타내었다. 이와 같은 결과는 cytokine gene과 suicide gene을 동시에 이용하는 combinational gene therapy가 간암을치료하고 재?을 시사한다.

Abstract ▼

In the last decade scientific and technical advances in molecularbiology have enabled the scientists to identify the genetic origins of human diseases,especially in the area of oncology. A variety of tumor suppressor genes and morethan 100 oncogenes have been identified. In addition, t

In the last decade scientific and technical advances in molecularbiology have enabled the scientists to identify the genetic origins of human diseases,especially in the area of oncology. A variety of tumor suppressor genes and morethan 100 oncogenes have been identified. In addition, the concept that the immuneresponse may be manipulated to eliminate established neoplasms made tumorimmunologists to figure out the function of many genes encoding cytokines andco-stimulatory factors in the tumor-specific immunity. These advances haverevolutionized our ability to treat patients with cancer. However, successfurl genetherapy for cancer has been elusive. So far, several genes have been used for thecancer gene therapy. Of those, cytokine genes can be transferred to tumor cells toenhance development of tumor immunity. Wild type tumor suppressor gene(p53) isused for inducing apoptosis of cancer cells carrying mutaton(s) on the gene. Otherpowerful therapeutic gene in gene therapy is a suicide gene such as the herpes simplexvirus thymidine kinase gene (HSV-tk). Death of tumor cells modifeid with theHSV-tk gene leads to killing of unmodified insitu tumor cells in a phenomenon termedthe "bystander effect".Hepatocarcinoma is one of the most common cancer in Korea. Many medicalinstitution have tried to improve the cure rate of the hepatocarcinoma, the prognosis isstill poor. Therefore, a new technology other than conventional chemotherapy,radiotherapy, or surgery is required for the improvement in the prognosis ofhepatocarcinoma.In this study, we have tried to develope multiple gene expression retroviral vectorsystem and gene therapy model of hepatocarcinoma. The multiple gene expressionvector encoding the IL-2 and the HSV-tk genes in addition to neo selectable markergene may be more efficient and can be applied to most cancer types. Therefore, theefficacy of combination therapy with the suicide gene and the cytokine gene to treathepatoma was investigated. The functionality of the recombinant retroviral vectors(LNC/IRES/TK and LNC/IL2/IRES/TK) was illustrated by transduction of chemicallytransformed mouse BNL 1ME A. 7R. 1 (ATCC TIB-75) cells in vitro, followed bydemonstration of IL-2 production and killing effect including bystander effect by theHSV-tk gene. Tumor was established by inoculation of the TIB-75 cellssubcutaneously in syngeneic BALB/c mice. Viral producing cells (VPC) generatingvarious therapeutic genes were infected directly into the solid tumors with or withoutganciclovir treatment. While the tumors continued to grow in all animals treated witha control vector or a IL-2 vector in the absence of ganciclovir treatment, those treatedwith the HSV-tk vector, with or without the co-expression of the IL-2 gene in thepresence of ganciclovir treatment, exhibited dramatic necrosis and regression. We alsoexamined the systemic antitumoral immunity of the vectors. Interestingly, only micetreated with the tumor cells expressing the both genes developed an effective systemicantitumoral immunity against challenges of tumorigenic doses of parental tumor cellsinoculated at distant sites. The results suggest that combination gene therapy usingcytokine and suicide genes can be a powerful approach for treatment of liver cancer.

목차 Contents

• 본 문...7
• 1) 서론...7
• 2) 연구방법 및 이론...12
• 3) 결과...14
• 4) 고찰...19
• 5) 결론...20
• 6)인용문헌...21
• 기 타...24
• 1) 논문발표목록...24
• 2) 자체평가서...25