초록 ▼

① 배지 및 환경요인의 최적화 플라스크 실험에서 현재까지의 최적조건(Soybean flour 1.5%, D-glucose 0.5%, Na₂HPO₄ 0.05%)의 조성을 갖는 배지(37℃, initial pH 9, 160 rpm)에서 28시간 배양하였을 때 약 1,400 unit/ml의 활성을 얻을 수 있었다. Bioreactor 실험에서 플라스크 배양에서 최적화한 배지성분의 2배의 농도에서 배양하여 aeration을 좋게 하고(800 rpm, 1.2 vvm), 온도를 25℃로 하였을 때 20 시간 전후에서 약 1,500 unit/m

① 배지 및 환경요인의 최적화 플라스크 실험에서 현재까지의 최적조건(Soybean flour 1.5%, D-glucose 0.5%, Na₂HPO₄ 0.05%)의 조성을 갖는 배지(37℃, initial pH 9, 160 rpm)에서 28시간 배양하였을 때 약 1,400 unit/ml의 활성을 얻을 수 있었다. Bioreactor 실험에서 플라스크 배양에서 최적화한 배지성분의 2배의 농도에서 배양하여 aeration을 좋게 하고(800 rpm, 1.2 vvm), 온도를 25℃로 하였을 때 20 시간 전후에서 약 1,500 unit/ml의 최대효소활성을 얻을 수 있었다. ② 혈전용해효소 정제 조건의 검토 및 부분 정제 결과를 요약하면 EtOH 침전과 DEAE A-50 두 단계만으로도 140배의 농축이 가능하였다. 수율이 83%로 매우 높았으므로 이 단계에서 상품화가 가능할 것으로 판단되며, gel filtration을 거칠 경우 약 900배의 농축이 가능하나 수율은 30%정도 감소함을 알 수 있다. 정제 효소의 N-말단 아미노산 염기서열을 결정한 결과 A-Q-S-V-P-Y-G-V-S-Q-I-K-A-P로 타혈전용해효소와 다른 물질임은 물론 타 단백질 분해효소와도 동일하지 않는 신물질로 판단되었다. ③ 식품형태의 개발 발효된 대두를 powder화하여 효소 안정성을 조사한 결과 약 80일 정도 경과 후에도 활성을 그대로 유지하였다. 영양학적으로 볼 때에도 발효된 대두는 발효되지 않은 대두보다 20%의 단백질과 지방을 더 함유하고 있었으며 이로부터 발효대두는 기능성 식품으로의 가치가 충분하다는 것을 알 수 있었다. ④ 혈전용해효소 클로닝 20,000배의 transformants로부터 Luria-Bertani에 tooth pick를 사용 replication하고 그 위에 fibrin layer를 덮어 fibrin clot를 분해하는 positive clone을 1차 screening하였다. Positive clone으로부터 plasmid를 분리한 뒤 cloning에 사용한 HindⅢ enzyme으로 digestion하여 ligation시킨 결과 3.4 Kb의 insert을 확인할 수 있었다. 분리한 recombinant plasmid가 host cell에서 안정된 활성을 가지는 fibrinolytic enzyme을 expression시킬 수 있는가를 확인하기 위하여 정제된 plasmid를 retransformation시킨 후 생성되는 transformant의 fibrinolytic activity를 측정한 결과 활성을 나타냄을 확인하였다.

Abstract ▼

The production and purification of a fibrinolytic enzyme(BK-17) from Bacillus subtilis BK-17 was studied for the commercial application of the enzyme. In the flask culture, soybean flour was the best nitrogen source and the concentration of 1.5% resulted in the highest enzyme yeild. For carbon sourc

The production and purification of a fibrinolytic enzyme(BK-17) from Bacillus subtilis BK-17 was studied for the commercial application of the enzyme. In the flask culture, soybean flour was the best nitrogen source and the concentration of 1.5% resulted in the highest enzyme yeild. For carbon source and inorganic salt, 0.5% D-glucose and 0.05% Na₂HPO₄ gave the best result. Optimal temperature and optimal initial pH were 37℃ and 9, respectively. Enzyme production was greatly enhanced with increasing agitation speed in the range of 100∼300 rpm or decreasing flask working volume in the range of 25∼100ml. The maximum enzyme production under the optimal flask culture condition was 1400 unit/ml with urokinase as standard. In the bioreactor culture, cell growth, enzyme activity, glucose concentration, pH and DO were monitored. With proper preculture no lag phase was observed in cell growth. During exponential phase, DO and pH rapidly decreased and the maximum specific growth rate was 1 hr/sup -1/. Enzyme production started at late exponential phase and continued for 5∼6 hr with rapid glucose consumption. With increasing agitation speed in 400∼800 rpm and air flow rate in 0.4∼1.5 vvm, enzyme production started earlier and its maximum activity in the culture medium increased. Optimal medium composition was ; 3% soybean flour, 1% glucose, and 0.1% Na₂HPO₄. Under the optimal bioreactor culture conditions, the same maximum enzyme yield as flask result, 1400 unit/ml, was obtained. For the purification of BK-17, culture broth was precipitated by 55-70% EtOH. Precipitated proteins were fractionated by DEAE sephadex A-50 chromatography in tris-buffer(20 mM, pH 7.5). Specific activity increased by 139-fold. When the enzyme solution was further purified by sephadex G-75 gel filtration, specific activity increased by 900-fold. The molecular weight of purified enzyme as determined by SDS-PAGE was 31,000 Da. The enzyme was thermostable and had pH stability in pH 6.0∼9.0. The enzyme had a high specificity on fibrin and lysed fibrin directly. Solid fermentation using cooked soybean was also carried out. The fermented bean showed a high fibrinolytic activity of fibrin plate and the enzyme activity of the dried powder was maintained for over 80 days at 4℃. On nutritional analysis fermented soybean bad a 20% more protein and lipid than the unfermented one. It was possible to make tablet or capsule from the dried powder with starch and some other additives. For cloning the BK-17 gene, chromosomal DNA of B. subtilis BK-17 and plasmiad vector vector pUC19 were digested by the restriction enzyme Hind Ⅲ. These fragments were mixed and T₄ ligase was added. After ligation, the recombinant plasmid was transfered into E. coli sure cell, and the transformant having a fibrinoytic activity was obtained. The size of insert fragment in the recombinant plasmid was 1.4 Kb.

목차 Contents

• 제 1장 서론...11
• 제 1절 연구개발의 배경...11
• 제 2절 연구개발의 목적과 범위...12
• 제 3절 현재의 연구 동향...14
• 제 2장 효소의 대량발효생산 분야...16
• 제 1절 서설...16
• 제 2절 재료 및 방법...16
• 제 3절 결과 및 고찰...22
• 제 3장 효소정제 및 특성 분야...64
• 제 1절 서설...64
• 제 2절 재료 및 방법...64
• 제 3절 결과 및 고찰...68
• 제 4장 식품형태개발 분야...86
• 제 1절 서설...86
• 제 2절 재료 및 방법...86
• 제 3절 결과 및 고찰...90
• 제 5장 유전자 조작 분야...96
• 제 1절 서설...96
• 제 2절 재료 및 방법...96
• 제 3절 결과 및 고찰...99
• 참고문헌...104