초록 ▼

가. 캐라틴태 단백질 추출 및 정제 - 물리적인 방법에 의한 추출시 단백질함량 및 소화율과 추출정도 확인 하였으며, ball mill로 분쇄 후 130℃에서 240분 열처리하는 것이 최 적조건이라고 할 수 있다. - 화학적 방법인 DMF처리에 의한 공정을 통하여 4가지의 형태로 캐라 틴 단백질이 분해된 분해물로 추출 정제하였다. - 분리된 단백질의 종류별로 전기영동 pattern을 통하여 캐라틴태 단백 질이 분자량을 측정하였는데 원료우모는 약 44,500-66,200Da, 분쇄 후 화학적 방법으로 처리한 우모는 10,700-25,0

가. 캐라틴태 단백질 추출 및 정제 - 물리적인 방법에 의한 추출시 단백질함량 및 소화율과 추출정도 확인 하였으며, ball mill로 분쇄 후 130℃에서 240분 열처리하는 것이 최 적조건이라고 할 수 있다. - 화학적 방법인 DMF처리에 의한 공정을 통하여 4가지의 형태로 캐라 틴 단백질이 분해된 분해물로 추출 정제하였다. - 분리된 단백질의 종류별로 전기영동 pattern을 통하여 캐라틴태 단백 질이 분자량을 측정하였는데 원료우모는 약 44,500-66,200Da, 분쇄 후 화학적 방법으로 처리한 우모는 10,700-25,000Da 정도로 확인되었다. - 물리적 처리 방법(Colloid mill, Bali mill)에 의해서 360분 autoclaving시 pepsin 소화율이 90% 이상으로 증진됐다. 물리적으로 분쇄후 다시 화학적 방법(Dimethylformamide)으로 케라틴 단백질 fraction을 분리하여 pepsin 소화율 측정 시 protein I fraction의 경 우에 99% 이상으로 가장 높게 증진됐다. - 우모분 1 Kg 이상 처리할 수 있는 시작장치는 온도를 조절할 수 있는 이중 자켓솥과 대형 교반기를 이용하였다. 나. 발효우모분에 대한 아미노산 이용률 평가 시험 - 동물사육 시험에 의한 아미노산 이용률 평가 결과 카제인 단백질은 94.58%, 케라틴 단백질(Protein fraction I)은 93.61%, 원료 우모 분은 15.49%로 케라틴 단백질의 경우에 카제인과 거의 유사한 아미 노산 이용률을 나타냈다. - 발효우모분의 생체내 아미노산 이용률은 83.67%, ball mill로 분쇄한 아미노산 이용률은 71.70%, autoclave한 우모분의 경우 75.72%로 측정 되었다. 모두 대조구 casein의 아미노산 소화율 96.78% 보다는 낮은 성적이었다. 그러나 발효처리에 의해서 아미노산 이용률이 증진됐다는 것이 확인되었다. 다. 식이 단백질 소재로 이용 가능성 검토 - 다이어트 식품으로 이용하기 위하여 쌀, 감자 및 메밀가루를 주원료로 하여 죽을 제조하여 관능검사를 실시하였다. 그 결과 우모분의 적정 첨가량은 5% 이내에 첨가하는 것이 바람직하였다. - 소시지 제조시 단백질원으로 가능성을 검토하기 위하여 대량의 우모단 백질을 물리적 방법으로 분쇄하여 돼지고기의 대체시험시 관능검사 결 과 5% 첨가군에서 가능성이 제시됐으나 향후 보완시험이 필요하다. 라. 우모 분해미생물 활용 시험 - 총 360균주를 양계장의 폐기분뇨 토양으로부터 순수분리하여 이 중 우모분해능을 보인 50균주(FDB: Feather-Degrading Bacteria로 명명)를 별도 분리하였으며, 이들 FDB 균주를 다시 정밀 배양과정을 거쳐 매우 우수한 우모분해능을 보유하고 있는 20균주 및 양호한 분해능을 보유하 고 있는 9균주 등 총 29종의 산업화가능 균주를 분리하였다. - 산업화가 가능하다고 판단되는 FDB균주 29개 균주를 임의 선정하여 지 속적인 enrichment culturing에 의하여 그 분해능의 상승을 도모 하였으며 이중 가장 안정된 growth pattern을 보인 FDB11-11에 대해 최적 조건을 산정하였다(pH7.0 at 45℃). - 산업화 가능 29종의 균주를 포함한 50종의 FDB균주에 대해 생리·생화 학적 실험 및 전자현미경 등에 의한 morphological test를 시행한 결과 Alkaligenes spp.로 동정되었다. - 케라틴 분해균주의 생육특성시험은 keratinase 생산을 위한 생육 최 적 조건을 선정하기 위해서 온도별, pH별로 조사결과 온도는 45℃, pH 8.5 였다. - 탄소원과 질소원의 공급 영향을 조사한 결과 질소원으로는 peptone, 탄소원으로는 glucose, sorbitol, maltose, fructose, cellobiose가 2배정도의 activity 증가를 보였다. - 케라틴 분해효소의 국재성 시험은 분해효소의 소재확인, 분획시험 (activity by ammonium sulfate fractionation), 여러가지 solvent, detergent, reducing agents가 keratinase activity에 미치는 영향, 다른 protease의 우모분해능을 조사했다. 15개 균주중 FDB11-11 균 주가 다양한 extracellular protein을 생산한다는 것을 확인하였다. 분자량은 21,000에서 31,000dalton사이 protein임. 배지내 적정 우모 의 함량은 1% 였다. - 기 선발한 우수균주 FDB11-11이 생산하는 우모분해효소를 얻기 위해 feather-containing broth(2ℓ)에 FDB11-11을 접종한 후 45℃에서 14 일간 배양하여 그 배양액을 원심분리한 상등액을 얻었음. - keratinase의 one step purification strategy 개발을 위해 large scale induction 실험을 시행하고 이를 전기영동에 의해 확인하였음. FDB11-11 균주는 small scale에서 분자량 21,000dalton - 31,000 dalton 범주에 2 종류의 protein이 induction됨이 확인되었음. - 우모분해효소의 부분정제는 Sephadex G-50 gel filtration column chromatography와 각 fraction을 SDS-PAGE 실험 결과 분자량 20,000 이하의 작은 protein들이 제거되었음을 확인하였다. - 정제효소의 pH, 열, 용매안정성 규명은 부분정제액을 이용하여 pH(2 - 10), 온도(30℃ - 100℃), 용매(ethanol, chloroform, ether 등)에서의 안정성 실험을 진행하였다. - 이종유전자표지(heterogeneous gene probe)에 의한 우모분해효소의 유 전자 탐색: FDB11-11 chromosome에의 PCR amplication fragment탐색 하였다. 마. 산업화 공정 개발 - 산업화 가능한 최적 발효 starter를 개발하기 위하여 FDB11-11균주와 FDB21-6, FDB24-1, FDB26-1 균주를 단독 혹은 혼합 배양하여 우모분 해능을 조사한 결과 FDB11-11균주와 FDB26-1 균주를 동시 접종한 starter가 가장 우수하였으며, 산업화 공정 중, starter 도입 최적점을 판 단하기 위한 feather meal 발효 시험 결과 별 아이가 없어 혼합 starter 는 milling 공정 전후에 공히 투입 가능한 것으로 판단되었다.

Abstract ▼

The object of the research is that keratinaceous material such as poultry feathers are ground by physical methods and extracted by DMF( dimethyl formamide) as well as by enzyme processing methods to yield high levels of digestible protein which is suitable for using as a feed or food supplements for

The object of the research is that keratinaceous material such as poultry feathers are ground by physical methods and extracted by DMF( dimethyl formamide) as well as by enzyme processing methods to yield high levels of digestible protein which is suitable for using as a feed or food supplements for animals and humans, respectively. 1. Isolation and purification of keratinaceous protein · Protein content and protein digestibility of feather meal by physical processing method were determined. Optimal condition to improve digestibility was at 130℃ for 240 minutes by steam treatment after grinding by ball mill. · After the chemical treatment of DMF to grind poultry feathers, 4 protein fractions were isolated and purified. · Degradation of keratinaceous protein was confirmed by SDS-high density gel chromatography. Molecular weights of protein in raw feather meal was measured as approximately 44,500 - 66,200 daltons. However, molecular weights of keratinaceous protein by DMF treatment was approximately 10,700-25,000 daltons. · Pepsin digestibilities of feather meal was increased over 90% by physical treatment (colloid mill, ball mill or autoclave for 360 minutes ). Pepsin digestibility of keratinaceous protein fraction 1 was improved to 99% by physical and chemical treatments, simultaneously. · Double jacket cooker to control temperature and big stirrer in laboratory scal (1 Kg of feather) were used for isolation of keratinaceous protein. 2. Amino acid digestibility of the fermented feather meal · In vivo digestibility of amino aids were 94.58% for casein protein, 93.61 % for keratinaceous protein fraction 1, and 15.49% for raw feather meal. · In vivo availability of amino acid of keratinaceous protein fraction was similar value to amino acid digestibility of casein. · In vivo digestibility of amino acid of the fermented feather meal was evaluated as 83.67%. Digestibility of amino acid were 71.70% for ground feather meal by ball meal 75.72% for autoclaved feather meal, and 96.78% for casein. It was confirmed that amino acid digestibility of feather meal was significantly improved by fermentation. 3. Possibility for using as dietary protein · Diet food was formulated with rice, potatoes, and buckwheat powder as main ingredients. Sensory evaluation was carried out in order to optimize supplemental level of ground and fine feather meal to pastes. Optimal level of ground feather meal was below 5%. · In order to use ground feather meal instead of pork for making sausages, 5% level of ground feather meal was acceptable in sensory evaluation. However, it is necessary further research to improve the quality of sausages. 4. Isolation of bacteria which had feather-degrading ability · 360 strains of bacteria were isolated from feather waste and soils, and tested for their feather-degrading ability. Among 50 strains which showed good feather-degrading ability, 29 strains were finally selected for their excellent feather-degrading ability. · Enhancing microbial digestibility of feathers upto the industrially effective level: Enrichment culturing was carried out for the selected 29 strains of FDB, and strain FDB11-11 which exhibilted the most stable growth pattern in the feather-enriched media was assessed for its optimal growth conditions(pH7.0 at 45C) · Identification of the bacteria: Selected 29 strains of FDB were identified as Alkaligenes spp. by biochemical and physiological tests as well as morphological observation with electron microscope. · Assessing the optimal condition of growth and activity production of feather-degrading bacteria(FDB): The optimal condition of growth and prodction of keratinolytic activity of FDB strain 11-11 was 45C in temperature, 1% in feather meal content, and pH8.5. · Location of keratinolytic enzyme in the bacterial cell: Upon SDS-PAGE of culture supermatants and its ammonium sulfate precipitates confirmed that the enzyme was extracellularly secreted protein, and that it was inducible by presence of feathers in the media. The apparent molecular weight of the enzyme was calibrated between 21,000 and 31,000 dal. The enzymatic activity of the keratinase was optimal at pH8.0, 37C. There was active serine at the active site of the enzyme. · Assessing the conditions for the activity production and feather meal: Feather meal was produced by fermentation of feather waste with the strain FDB11-11 at 45C for 9 days, digestibility of the feather meal was assessed. The effects of concentration of the fermented feather meal and sources of the feather meal including commercially available ones on the production of enzyme activity of the strain FDB11-11 were monitored. · Defining molecular characteristics of keratinolytic enzymes at the industrial level: Thermostability of partially purified keratinase from the strain FDB11-11 was remarkable; 30% of total activity survived 100C. It was stable between pH 5.0 and 7.0, while 60% of activity remained at pH 8.0 to 9.0. The enzyme activity was stable in ethanol, while it was very unstable in ethyl acetate. · Characterization of the genetic properties of the keratinolytic enzymes: The genetic determinant of keratinase was located on the chromosomal DNA. However, 5´-CAACCGTTCCTTACGGCATTCCTC-3´ which was prepared from DNA sequence of keratinase from Bacillus licheniformis did not produce any detectable DNA on PCR. 5. Development of industrial procedures to digest feather wastes: In order to develope the optimal starter cultures for the industrial uses, combinatorially mixed cultures of the strain FDB11-11 with the strain FDB21-6, FDB24-1, and FDB26-1 were prepared and tested for their feather digestibility. The best result in fermentability was obtained by the mixed starter culture of FDB11-11 with FDB26-1. 6. These research results will be immediately applied in the industrial fields as follws: · Keratinaceous protein of feather is very low in vivo digestibility. The concept of dietary protein is very similar to dietary fiber and feather meal ground by ball mill is possibility to use for dietary protein. It is very seldom to find out the references for using of dietary protein through the processing of feather around the world. It is necessary to study the dietary protein in the future as well as to establish the concept of the dietary protein. · development of biological reagents to ferment mixed waste of feather and other products, · development of microbial fertilizer, · development of biological converter of feather into easily digestible feed.

목차 Contents

• 제 1 장 서 론...23
• 제 1 절 연구개발의 목적과 범위...23
• 제 2 절 기존 연구사례...28
• 제 3 절 국내 우모분의 생산현황 및 사용실태...38
• 제 2 장 캐라틴태 단백질 추출 정제분야...45
• 제 1 절 서 론...45
• 제 2 절 재료 및 방법...47
• 제 3 절 결과 및 고찰...52
• 제 3 장 우모분의 사료가치 평가 및 아미노산 이용률 평가...75
• 제 1 절 서 설...75
• 제 2 절 재료 및 방법...79
• 제 3 절 결과 및 고 찰...80
• 제 4 장 식이단백질 가능성 검토...115
• 제 1 절 서 설...115
• 제 2 절 재료 및 방법...115
• 제 3 절 결과 및 고 찰...123
• 제 5 장 참고문헌...133