보고서 정보
주관연구기관 |
연세대학교 Yonsei University |
연구책임자 |
서활
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참여연구자 |
한창동
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발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2000-05 |
주관부처 |
보건복지부 |
사업 관리 기관 |
연세대학교 Yonsei University |
등록번호 |
TRKO200200022437 |
DB 구축일자 |
2013-04-18
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키워드 |
자연골 형성.골형성인자.인공골.natural bone induction.bone morphogenetic protein.artificial bone.
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초록
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외상에 의해 손상된 골조직뿐만 아니라 고의 형태가 선천적으로 기형일 경우에 형태적 및 기능적 골수복을 위해서는 인공골 재료가 필요하다. 이러한 이식 가능한 인공골 재료는 생체적합성이 있어야하고, 재생되는 자연골에 의해 부분적으로 혹은 완전히 대치될수 있어야 하며, 골 유도능이 있어야 한다. 이러한 요구 사항들은 만족시키고자, 자연골 재생유도 인공골의 조직공학적 개발이 시도되었다. 본 연구에는 탄산아파타이드(carbonate apatite)와 제 I형 아텔로콜라겐(type I atelocollagen)으로 구성된 복합체 (중량비 88
외상에 의해 손상된 골조직뿐만 아니라 고의 형태가 선천적으로 기형일 경우에 형태적 및 기능적 골수복을 위해서는 인공골 재료가 필요하다. 이러한 이식 가능한 인공골 재료는 생체적합성이 있어야하고, 재생되는 자연골에 의해 부분적으로 혹은 완전히 대치될수 있어야 하며, 골 유도능이 있어야 한다. 이러한 요구 사항들은 만족시키고자, 자연골 재생유도 인공골의 조직공학적 개발이 시도되었다. 본 연구에는 탄산아파타이드(carbonate apatite)와 제 I형 아텔로콜라겐(type I atelocollagen)으로 구성된 복합체 (중량비 88:12)를 제조하였다. 소의 피부조직에서 추출·정제한 제 I형 아텔로콜라겐은 전기영동(SDS-PAGE) 분석에서 대조군인 제 I형 콜라겐(Sigma C 3511)과 거의 유사한 밴드 패턴을 나타내었다. 주사전자현미경(SEM) 분석결과 58℃에서 합성한 탄산아파타이드와 980/1,200℃에서 소결(sintering) 한 탄산아파타이트는 자연골과 유사한 결정성을 나타내었으며, 풍부한 다공성(평균 pore 크기: 직경 3-10㎛)을 가짐을 알 수 있었다. 또한, 적외선 분광분석법(FT-IR spectroscopy)을 통해 58℃에서 합성한 탄산아파이트에서 탄산(CO??)이온에 대하여 특징적인 흡수대를 명확하게 관찰할수 있었다. 콜라겐 분자들 간의 분자내 가교화 정도를 증가시키기 위해, 아파아티트-콜라겐 복합체에 4시간동안 자외선을 조사(UV-irradiation method) 하거나 150℃에서 2시간동안 진공-건조(dehydrothermal method)하였다. 비가교화 복합체에 비하여, 자외선 조사 혹은 고온 진공-건조에 의해 가교화된 복합체가 통계학적으로 의미있게 (p<0.05)더 낮은 콜라겐 분해 및 수분함유(swelling)비율을 나타내었다. 또한 제조된 아파타이트-콜라겐 복합체에 대하여 생체역학적 특성, 세포독성 등의 생체 적합성을 평가하였는데, 예비적인 역학적 시험 결과는 아파타이트-콜라겐 복합체의 압축 강도가 자연골에 대한 수치보다 더 높았다는 것을 보여 주었다. 직접 접촉법 및 추출액을 이용한 간접법에 의한 세포독성 시험결과, 제조된 아파타이트-콜라겐 복합제가 balb 3T3 섬유아세포에 대해 세포독성이 없는 것으로 밝혀졌다.한편, 골형성인자(bone morphogenetic protein)는 osteosarcoma 세포로부터 분리하거나 E.coli 발현 시스템을 이용하여 획득하였으며, 제조된 아파타이트-콜라겐 복합체에 코라겐의 1/10.000의 비율로 함유되었다. 분리된 골형성인자를 Sprague-Dawley 계의 주의 두개골로부터 분리한 골아세포에 처리하였을때, alkaline phospatase(ALP)의 활성도가 처리하지 않은 대조군에 비해 통계학적으로 유의하게 (p<0.05) 증가하였으며 calcium deposit 역시 현저하게 유도됨을 관찰할수 있었다. 골형성인자를 포함하지 않은 아파타이트-콜라겐 복합체에 비하여, 골형성인자가 함유된 복합체에 배양된 골아세포에 대한 ALP 활성도가 통계학적으로 유의한(p<0.05) 증가를 보여 주었다. 골아세포 부착성 연구결과, 980℃에서 소결한 탄산아파타이트와 아텔로콜라겐으로 만든 복합체에 대한 골아세포 부착성이 1,200℃에서 소결한 탄산아파트와 아텔로콜라겐으로 이루어진 복합체보다 통계학적으로 의미있게 (p<0.05)우수함을 알 수 있었으며, 콜라겐을 가교화시키는 방법의 측면에서는 통계학적인 유의성이 없었다. 골형성인자를 함유한 아파타이트-콜라겐 복합체에 배양된 골아세포가, 골형성인자를 포함하지 않은 복합체에 비하여 통계학적으로 유의하게(p<0.05) 증가된 세포 증식능을 나타냈었다. 동물 시험을 토끼의 요골에 인공적으로 골결손으로 만든 다음, 골형성인자를 함유하지 않은 복합체와 골형성인자를 함유한 복합체 및 동종골 (대조군)을 각각 이식하였다. 이식 이후 8주째에 골형성인자를 함유한 복합체에서는 방사선학적으로 골유합 및 골재형성의 소견을 보인 반면에, 골형성인자를 함유하지 않은 복합체는 부분적??유한 복합체가 더 많은 callus를 형성하는 것이 조직학적으로 관찰되었다. 그 밖에 조직학적 연구상으로는 어떠한 이상도 관찰되지 않았다.이러한 결과들은 본 연구에서 제조된 아파타이트-콜라겐 복합체가 골형성인자의 운반체로서 효과적으로 사용될수 있으며, 인공골 대체물로서 임상적으로 활용될 수 있다는 것을 제시해준다.
Abstract
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Bone defects from either extrinsic or intrinsic origin require additional bone substitutes for morphologic and functional restoration. An implantable bone substitute must be biocompatible, be partially or completely replaced by regenerating natural bone, and be osteoconductive or osteoinductive. To
Bone defects from either extrinsic or intrinsic origin require additional bone substitutes for morphologic and functional restoration. An implantable bone substitute must be biocompatible, be partially or completely replaced by regenerating natural bone, and be osteoconductive or osteoinductive. To meet these requirements, a natural bone inductive artificial bone was developed by tissue engineering.Composites composed of carbonate apatite(CAp) and type I atelocollagen (AtCol)(88/12 in wt/wt%) were designed in this study. Type I AtCol purified from bovine tail skins showed nearly similar band patterns to those of type I collagen purchased from Sigma(C3511) on SDS-PAGE. SEM characterization indicated that the CAp synthesized at 58℃ and sintered at 980/1,200℃ showed the crystallinity similar to that of natural bone, which had high porosity (mean pore size: about 3-10㎛ in diameter). FT-IR spectroscopy analysis showed that bands characteristic for carbonate(CO??) ions were clearly observed in the 58℃-synthesized CAp. To enhance the intramolecular cross-linking between collagen molecules, CAp-AtCol composites were irradiated by ultraviolet(UV) ray(wave length 254nm) for 4 hours(UV-irradiation method) or vacuum-linked composites, UV-irradiated or dehydrothermally cross-linked composites showed significantly (p<0.05)lower collagen degradation and swelling( or water uptake) ratio. Biocompatibility such as biomechanical property and cytotoxicity was evaluated for the CAp-AtCol composite. Preliminary mechanical data demonstrated that the compressive that the of the CAp-AtCol composites were higher than those values reported for bone. In vitro cytotoxicity tests by a direct contact method and an extract dilution method revealed that the CAp-AtCol composites have been shown to be cytocompatible for balb 3T3 fibroblasts.Bone morphogenetic protein (BMP) was isolated from osteosarcoma cells or obtained from E. coli expression system, and then the BMP was micro-injected into the fabricated apatite-collagen composite. When the acquired BMP was treated to rat calvaria osteoblasts, alkaline phosphatase (ALP) activity was significantly (p<0.05) increased, calcium deposit was remarkably induced. Osteoblast adhesion studies demonstrated that the composited disks with 980℃-sintered CAp and AtCol wre significantly (p<0.05) more adhesive to osteoblasts than those with 1,200℃-sintered CAp and AtCol. Proliferation studies showed that comparedwith the composite without BMP, ostepblasts grown in the composited combined with BMP expressed significantly(p<0.05) increased cell proliferation. Compared with the apatite-collagen composite without BMP, the ALP activity for osteoblasts cultured in the BMP-combined apatite-collagen composite also showed a significantly (p<0.05) substantial increase. Artificial total bone defects were created in rabbit radii, and allografts as controls and the composites with and without BMP were implanted into the defects. Bony union and incorporation of the BMP-combined composite were radiologically observed after 8 weeks, whereas the composite without BMP was partially resorbed. Moreover, compared with the composite without BMP, the BMP-combined graft was histologically observed to induce much callus formation. No histologic abnormalities appeared in the composite with and without BMP. These results suggested that the CAp-AtCOl composite prepared here can be effectively used as a delivery system for BMP and further applied to the clinical use as an artificial bone substitute.
목차 Contents
- 총괄연구개발과제 연구결과...7
- 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...7
- 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과...12
- 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...34
- 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...37
- 5. 총괄연구개발과제의 활용계획...40
- 6. 첨부서류...41
- 제1세부연구개발과제 연구결과...71
- 1. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...72
- 2. 제1세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...73
- 3. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...78
- 4. 제1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...102
- 5. 제1세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...105
- 6. 제1세부연구개발과제의 활용계획...106
- 7. 참고문헌...107
- 제2세부연구개발과제 연구결과...110
- 1. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...111
- 2. 제2세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...113
- 3. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...115
- 4. 제2세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...126
- 5. 제2세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...128
- 6. 제2세부연구개발과제의 활용계획...129
- 7. 참고문헌...130
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