초록 ▼

핵산 분해물질인 allantoin은 효모에서는 질소원으로 사용되는데 이는 효모세포내에 질소원인 암모니아가 없을 때 allantoin분해 유전자들의 발현이 증가되어 allantoin을 분해하여 암모니아를 생산시킴으로서 이루어진다. Allantoin을 분해하는 유전자들의 발현은 transcription(전사) level에서 이루어지며 암모니아와 같은 좋은 질소원이 세포내에 존재할 때는 allantoin 분해 유전자들의 발현이 전혀 일어나지 않는다. 다른 질소원이 없을 때 allantoin 분해유전자인 DAL및 DUR 유전자들의 mRNA

핵산 분해물질인 allantoin은 효모에서는 질소원으로 사용되는데 이는 효모세포내에 질소원인 암모니아가 없을 때 allantoin분해 유전자들의 발현이 증가되어 allantoin을 분해하여 암모니아를 생산시킴으로서 이루어진다. Allantoin을 분해하는 유전자들의 발현은 transcription(전사) level에서 이루어지며 암모니아와 같은 좋은 질소원이 세포내에 존재할 때는 allantoin 분해 유전자들의 발현이 전혀 일어나지 않는다. 다른 질소원이 없을 때 allantoin 분해유전자인 DAL및 DUR 유전자들의 mRNA의 생산이 증가되고 이어서 분해효소가 합성되어짐으로서 allantoin이 암모니아와 CO₂로서 분해된다. Allantoin분해 유전자들의 발현에 관여하는 인자들은 DNA element로서 각 promoter DNA sequence에 UAS, UIS, URS가 이미 밝혀졌고, 이 DNA element와 반응하는 DAL81, DAL82, DAL80와 같은 trans-acting cellular protein factor들이 있음이 제시되었다. 본 연구에서는 이미 밝혀진 전사조절에 관련되는 promoter부위의 cisacting DNA element와 직접 binding하거나 간접적으로 다른 factor를 통해 binding하는 trans-acting protein element들을 동정하고 이들이 allantoin 분해 유전자의 전사에 미치는 효과를 조사하고자 DNA-protein 상호작용 연구를 시도하였다. Allantoin에 의해 발현이 유도되는 allantoin분해 유전자중에 하나인 DAL7유전자 promoter의 upstream activation sequence(UAS), upstream induction sequence(UIS), upstream represion sequence(URS)에 작용하는 trans-acting element를 동정하기 위하여 UAS, UIS, URS를 radioactive하게 labeling하고 효모의 cell extract를 반응시켜 UAS, UIS 또는 URS에 직접 반응하는 protein을 gel-retardation assay를 통해 확인하였고, 유전학적인 분석으로 이미 밝혀진 transacting positive regulatory element DAL81, DAL82 및 transacting negative regulatory element인 DAL80가 어떻게 UAS, UIS, URS와 결합하여 유전자의 전사를 유도하는지 조사하기 위하여 DAL81, DAL82 및 DAL80 protein을 E. coli 내에서 다량 발현시켜 얻어진 protein을 직접 사용하여 gel retardation을 시도하였다. 또한 DNA에 직접 binding하지 않고 protein-protein 상호작용을 통해 작용하는 trans-acting factor들을 동정하고자 trans-acting factor인 DAL80을 immobilize시키고 S35로 labeled된 효모cell extract를 반응시켜 DAL80 trans-acting factor에 반응하는 protein을 동정하였다. 전사조절 trans- acting protein의 유전자를 cloning하기 위하여 homology를 이용한 genomic library로 부터 screening하는 방법을 시도하였다.

Abstract ▼

Transcriptional regulation of expression of genes in eucaryotic cells is controlled by the cellular factors interacting with the DNA elements in promoter regions. The interaction between the sequence specific DNA elements (cis-acting regulatory elements) and transcription factors is tightly regulate

Transcriptional regulation of expression of genes in eucaryotic cells is controlled by the cellular factors interacting with the DNA elements in promoter regions. The interaction between the sequence specific DNA elements (cis-acting regulatory elements) and transcription factors is tightly regulated according to the physiological needs and is changed to activate or repress the function of RNA polymerase Ⅱ which actually transcribes the specific DNA. Transcription factors have shown to be mostly proteins and some of them are trans-acting DNA binding proteins. However, the mechamisms how trans-acting factors are actually regulating the gene expression have not been clearly elucidated due to the fact that it is rather difficult to isolate and purify the specific trans-acting protein factors in pure forms. Thus, it is necessary to have new methods to identify and purify the sepecific trans-acting proteins. In this study, using allantoin degradation gene system in Saccharomyces cerevisiae, we tried to obtain large quantity of the trans-acting proteins, DAL81, DAL82, and DAL80 which were already shown to be positively and negatively regulating the expression of allantoin degradative genes by the methods of glutathione-S-transferase(GST) fusion system. We characterized their DNA binding activities with cis-acting DNA sequences of the system, and identified new cellular protein factors interacting with these trans-acting factors through protein-protein interactions. The DAL81, DAL82, and DAL80 genes were fused to GST gene at the 3'terminus and the GST-DAL fusion genes were introduced in to E. coli. After induction of the expression of the GST-DAL fusion genes, the GST-DAL proteins were purified by the glutathione-agarose beads affinity chromatography. The GST-DAL fusion proteins were tested for their DNA binding activities on cis-acting DNA elements, upstream activation sequence(UAS), upstream induction sequences(UIS), and upstream repression sequences(URS) by gel retardation assays. The positive regulating factor, DAL82, was shown to be bound directly to the one of the cis-acting DNA element, UIS, and the negative regulating factor, DAL80, was shown to be bound to the UAS, URS, as well as UIS. It is considerded that, the DAL80 has mutifuntional binding domains. Thus, we examined further whether there are another protein factors which might interact with this DAL80 protein. When we mixed the glutathione-agarose- GST-DAL80 affinity beads with yeast cell extract labeled with 35S-Methionine, a 52 kilodaltone new protein which bound to the C-terminal region of the DAL80 protein was detected. This newly found 52 kilodalton protein seems to be involved in the complex formation in regulation of allantoin expression through protein-protein interaction. This study shows that GST-fusion system seems to be a useful method to purify and identify the protein factors in the cells and we need to study further to characterize the function of the newly found 52 kilodalton protein.

목차 Contents

• 제1장 서 론...17
• 제2장 실험재료 및 방법...20
• 제1절 실험재료...20
• 1. 균주...20
• 2. Plasmid 및 DNA...20
• 3. 배지...21
• 4. 제한효소 및 시약...22
• 5. Oligonucleotide 및 PCR...22
• 6. Radiochemical...22
• 제2절 실험방법...23
• 1. E. coli transformation...23
• 2. Plasmid DNA 분리...23
• 3. PCR (polymerase chain reaction)...24
• 4. GST-DAL81, GST-DAL82 및 GST-DAL80 fusion plasmid 제조...24
• 5. GST-DAL fusion protein 제조 및 정제...25
• 6. 효모세포의 배양 및 total protein extract의 제조...26
• 7. Gel retardation assays...27
• 제3장 결과 및 고찰...28
• 1. Trans-acting protein factor DAL81, DAL82 및 DAL80의 gluathione-S transferase(GST) fusion plasmid의 제조...28
• 2. GST-DAL protein의 제조...29
• 3. GST-DAL fusion protein의 정제...31
• 4. GST-DAL fusion protein들의 cis-acting DNA element들과의 binding activity의 분석...32
• 5. Negative regulatory trans-acting factor인 DAL80 protein의 DNA binding region의 분석...35
• 6. DAL80 protein과 association 되는 다른 protein의 동정...36
• 제4장 결론 및 건의사항...38
• 참고문헌...42
• Tables...43
• Figures...45