초록 ▼

Ⅰ. 제 목 유용효모의 표면발현 시스템 구축 및 신생물촉매 적용기술 개발 Ⅱ. 연구개발의 목적 및 필요성 세포의 표면발현기술은 비교적 최근에 발달한 유전공학 기술로서 세포의 표면에 존재하는 단백질 유전자에 외래유전자를 연결하여 발현함으로써 외래단백질을 세포의 표면에 부착시키는 방법이다. 이러한 표면발현기술은 초기에는 미생물의 표면에 다양한 항원성 또는 항체성의 polypeptide를 노출시켜 항원 항체의 스크리닝에 목적을 두고 개발되어 각종 peptide 항체 library의 제조, 다양한 생백신 (live vacci

Ⅰ. 제 목 유용효모의 표면발현 시스템 구축 및 신생물촉매 적용기술 개발 Ⅱ. 연구개발의 목적 및 필요성 세포의 표면발현기술은 비교적 최근에 발달한 유전공학 기술로서 세포의 표면에 존재하는 단백질 유전자에 외래유전자를 연결하여 발현함으로써 외래단백질을 세포의 표면에 부착시키는 방법이다. 이러한 표면발현기술은 초기에는 미생물의 표면에 다양한 항원성 또는 항체성의 polypeptide를 노출시켜 항원 항체의 스크리닝에 목적을 두고 개발되어 각종 peptide 항체 library의 제조, 다양한 생백신 (live vaccine) 의 제조 뿐만 아니라 세포표면에 다양한 생리활성효소나 금속이온 결합단백질의 고정화를 통하여 고부가가치의 물질생산을 위한 전세포 생물촉매 (whole cell biocatalyst) 및 폐수처리용 전세포 흡착제 (whole cell absorbent) 의 개발 등에 이용되어 왔다. 최근에 이르러서는 directed evolution과 functional genomics의 등장에 따라, 표면 발현 연구의 새로운 계기가 마련되고 있다. phage surface display를 이용한 리셉터, 리간드의 결합 연구, 리셉터의 개량등이 최근 활발히 연구되고 있으며, 박테리아에 효소를 표면 발현함으로써 보다 활성이 개량된 효소에 대한 스크리닝 연구도 다양하게 진척되고 있다. 표면발현연구는 bacteriophage나 원핵세포인 대장균 및 그람양성 세균등에서 다양한 표면단백질을 매개로 이용하는 기술이 개발되었으며 현재 산업적으로 응용성을 넓혀 나가고 있는 추세이다. 그러나 이 시스템의 사용에 있어서 고밀도 표면발현이 가능한 경우는 약 50-60 amino acid로서 display할 수 있는 단백질의 크기에 한계가 있고 효소와 같은 분자량이 큰 단백질을 display할 수 있는 경우는 표면발현의 밀도가 매우 낮으며 진핵세포 유래의 분비단백질등이 세균에서는 제대로 folding되지 않아 활성이 없는 문제점등이 단점으로 지적되고 있다. 최근에는 이러한 원핵세포를 이용한 표면발현의 단점을 보완할 수 있는 새로운 표면발현 시스템으로서 진핵세포인 효모 Saccharomyces cerevisiae에서도 그 가능성이 입증되어 최근 세포표면과 관련된 기초 연구와 더불어 이의 응용연구가 폭발적으로 증가하고 있다. 그러나 효모 S. cerevisiae는 분자유전학적 연구가 많이 되어 있어 이용에 장점이 있으나 외래유전자 발현에 있어 발현율이 낮은 단점이 있고 표면발현을 위해서 주로 사용되고 있는 α-agglutinin은 spore를 형성하는 완전효모 (perfect yeast) 에서만 발견되는 단백질이기 때문에 산업적 가치를 갖는 많은 효모가 불완전효모 (imperfect yeast) 라는 점을 고려할 때 범용으로 사용할 수 없는 단점이 있다. 따라서 산업적 응용성이 높은 다양한 효모에서 공통적으로 이용이 가능한 표면발현 매개단백질의 개발은 필연적으로 사료되어 본 연구에서는 산업적 유용성이 높은 효모중 하나인 Hansenula polymorpha 균주를 대상으로 하여 다양한 효모에서 이용이 가능한 세포벽부착 단백질을 스크리닝하고 이를 이용하여 새로운 표면 발현계를 개발하고자 하였다. Ⅲ. 연구개발의 내용 및 범위 1) 세포벽 부착 단백질의 분리 H. polymorpha의 신규 세포벽 부착 단백질의 분리를 위하여 효소 및 chemical 등을 이용하여 분리 시도하였으나 과도한 glycosylation으로 인하여 원하는 단백질을 분리할 수 없었다. 따라서, 다양한 당쇄 부가 결여 변이주를 개발하고 이로부터 세포벽 부착 단백질의 분리를 시도하였다. 2) 세포벽 부착 단백질 유전자의 cloning H. polymorpha의 세포벽 단백질 분포를 조사한 결과, β-mercaptoethanol 처리에 의하여 얻은 세포벽단백질 분포의 경우 알려진 S. cerevisiae의 양상과 매우 유사함을 확인하였으므로 S. cerevisiae에서 알려진 세포벽 부착단백질 유전자를 probe로 하여 H. polymorpha 균주의 세포벽 부착 단백질의 유전자를 분리하였다. 3) 세포벽 부착 유전자의 유전공학적 screening 표면 발현의 매개 유전자를 cloning하기 위하여 anchoring motif를 선별할 수 있는 벡터를 제조하여 anchoring motif의 screening을 시도하였다. Reporter enzyme으로 이용된 CMCase의 아미노 말단부위에 library를 구축하여 anchoring motif를 선별할 경우 매개 단백질의 카르복시 말단을 repoter enzyme 융합에 이용함으로써 기존의 motif와는 다른 새로운 motif를 선별할 수 있는 가능성이 높았으며, signal sequence를 포함한 새로운 promoter의 cloning도 가능하였다. 4) 표면 발현계 구축과 비교 분석 새로이 cloning된 세포벽 부착 단백질 유전자와, 기존에 보고된 유전자 중, 매개 단백질로 이용될 가능성이 있는 다양한 유전자에 대하여 표면 발현계를 구축하고 그 효율을 비교 분석하였다. 또한 다양한 reporter enzyme을 이용하여 비교 검토하고 최적의 표면 발현 매개 단백질을 선정하였다. IV. 연구개발결과 1) H. polymorpha 세포벽 부착 단백질의 특성연구 및 유전자 확보 세포벽 부착단백질의 분리와 분석이 용이한 세포벽 당쇄관련 돌연변이주 mnn9 및 pmt1 균주를 확보하고 특성을 분석한 결과 당쇄부가가 감소됨과 아울러 재조합 단백질의 분비효율이 증가하는 초분비 균주 개발의 부가적인 결과를 얻을 수 있었다. 또한 이 돌연변이주로부터 β-mercaptoethanol을 사용하여 disulfide로 부착된 형태의 세포벽 단백질 4 종을 분리하고 아미노산 서열을 분석하였다. 이 외에 세포벽 부착매개로서 보다 바람직한 GPI anchor type의 세포벽 단백질 유전자를 cloning 하기 위하여 Southern cloning 방법으로 H. polymorpha 의 새로운 매개 유전자 4종 (CWP1, TIP1, GAS1, SED1) 을 cloning 하고 염기서열 결정 및 분석을 완료하였다. 2) 표면 발현 매개 단백질의 비교 분석 목표 단백질로서 CMCase를 이용하여 매개단백질 4종의 표면발현을 위한 부착매개 효율성을 비교 분석하였다. 그 결과 plate assay를 통하여 세포표면으로의 이동과 세포외 분비의 저해정도를 서로 비교 관찰할 수 있었고 전세포에서의 활성을 정량적으로 측정한 결과 Gas1p, Cwp1p의 전체 유전자를 부착매개로 사용한 경우와 Cwp1p, Tip1p의 40개 말단 아미노산을 사용한 경우 효율적인 부착매개로 작용함을 확인할 수 있었다. 특히 Cwp1p의 경우 가장 효율적인 부착매개로 알려진 S. cerevisiae 유래의 Cwp2p (Sccwp2) 보다 훨씬 우수한 부착매개 효율성을 나타내었다. 기존에 세포벽으로의 이동이 확인된 2종의 세포벽 부착 매개 단백질인 Pir2p와 Wsc1p의 부착 매개 효율을 확인하였다. PIR2 유전자를 H. polymorpha로부터 cloning하여 CMCase를 표면 발현한 결과, 카르복시 말단을 이용한 경우 세포벽 부착이 되지 않았으나, 아미노 말단을 연결한 경우 세포벽으로 이동함을 확인하였다. Wsc1p의 유전자를 이용한 경우, 카르복시 말단의 transmembrane domain을 이용하여 목표 단백질이 세포벽에 부착됨을 확인하였다. CMCase를 이용한 실험에서 우수한 효율을 보인 4종의 유전자를 대상으로 Aspergillus niger 유래의 glucose oxidase를 표면 발현하였다. 이 실험을 통하여 Cwp1p가 가장 높은 효율로 세포벽으로 이동함을 확인하였다. 또한 새로운 매개유전자의 개발을 위해 기존 부착매개 단백질 유전자인 S. cerevisiae 유래의 AGα1을 기준으로 하여 S. diastaticus의 glucoamylase 유전자의 부착매개로서의 사용가능성을 확인한 결과, glucoamylase의 유전자가 CMCase를 S. cerevisiae의 표면으로 발현시킴을 확인하였다. Ⅴ. 연구개발결과의 활용계획 본 연구를 통하여 확보된 표면발현 매개단백질을 이용하여 산업적 효용성이 높은 효모 H. polymorpha에 다양한 효소를 표면발현한 전세포 생물촉매의 개발이 가능하게 되었고 선별된 매개시스템을 세균이나 안정성과 유용성이 높은 다른 희귀 효모에 대해서도 적용할 수 있을 것으로 판단된다. 또한 표면발현된 효소에 대한 directed evolution 기술개발을 통하여 생체 촉매의 초고속 기능개량이나 peptide library display 기술개발을 통한 screening 기술에 활용할 수 있을 것이며 세포표면에 세포외 signal을 매개하는 유전자를 표면발현한 세포를 이용한 biosensor 개발에도 활용할 수 있을 것으로 판단된다.

Abstract ▼

To develope a new surface display system in methylotrophic yeast Hansenula polymorpha, several putative cell wall proteins were cloned and tested. In Saccharomyces cerevisiae, immobilization of heterologous protein on the cell surface is possible by making use of the C-terminal GPI anchor domains of

To develope a new surface display system in methylotrophic yeast Hansenula polymorpha, several putative cell wall proteins were cloned and tested. In Saccharomyces cerevisiae, immobilization of heterologous protein on the cell surface is possible by making use of the C-terminal GPI anchor domains of glucanase extractable cell wall proteins. At first, we constructed two glycosylation mutant strains, mnn9 and pmt1, to inhibit the hyperglycosylation of the cell wall protein that hinders the purification of cell wall proteins. These two mutant strains, mnn9 and pmt1, which have defects in the N- and O-linked glycosylation, respectively, showed the supersecretion ability and some changes in cell wall protein profiles. This approach, however, could not render cell wall proteins purifiable. Therefore, we cloned potential GPI anchored cell wall protein gene homologues, Tip1p, Sed1p, Gas1p, and Cwp1p from H. polymorpha. These were tested as an anchoring motif for the surface expression of carboxymethyl cellulase (CMCase). The CMCase expression vector was constructed using the secretion signal sequence of killer toxin, CMCase from Bacillus sp., and either the entire mature part or the C-terminal 40 amino acids of the putative cell wall proteins. Most of the fusion proteins were incorporated into the cell wall and showed CMC hydrolyzing activity in the whole cell fraction. CMCase immobilized by the Cwp1p, Gas1p, and 40 amino acids of Tip1p was most effective in the hydrolysis of high molecular weight substrate, CMC, showing higher CMCase activity than anchored by the S. cerevisiae Cwp2p known as one of the most efficient anchor motifs in yeast. These results indicate that all four genes cloned from H. polymorpha have efficient surface targeting signals and, thus, show a great potential for a new cell surface anchoring system. In addition, Pir2p, another NaOH extractable cell wall protein, Wsc1p derived from H. polymorpha, and the glucoamylase serine/threonine-rich domain from S. diastaticus were also demonstrated to be possible surface anchors. The cell surface expression system of the present study is expected to provide an immobilization effect as biocatalysts by adhereing a desired protein to the cell surface, and a means of altering target protein characteristics such as binding affinity and stability for library screening.

목차 Contents

• 요약문...2
• 목 차...8
• 제 1 장 서 론...9
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황...13
• 제 3 장 연구개발 수행내용 및 결과...24
• 제 1 절 H .polym orpha 세포벽 부착단백질의 특성연구...24
• 제 2 절 H . polym orpha 세포벽 관련 돌연변이주 개발...29
• 제 3 절 H . polym orpha 세포벽 부착단백질의 유전자 확보...38
• 제 4 절 H .polym orpha 균주의 표면발현 기술 개발...53
• 제 5 절 S.cerevisiae의 새로운 표면발현 시스템 개발...69
• 제 4 장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도...76
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획...78
• 제 6 장 참고문헌...79
• 위탁연구: H.polymorpha표면 발현계 개발을 위한 유전학적 방법 개발...84