초록 ▼

1. 효모 promoter의 발현특성 및 강도 비교강력한 효모 promoter의 선별을 위해 기존에 알려진 발현 vector들로부터 promoter를 분리하여 비교적 활성 측정이 용이한 E. coli의 β-galactosidase 유전자인 lac Z유전자와 융합시켜 효모에서 β-galactosidase 활성을 측정한 결과로부터 비교적 강한 promoter인 GAL1-GAL10 promoter와 PHO5 promoter를 선별하였다.2. 다기능 효모 발현 vector의 개발 가. multicloning site의 도입효모에서 나타난

1. 효모 promoter의 발현특성 및 강도 비교강력한 효모 promoter의 선별을 위해 기존에 알려진 발현 vector들로부터 promoter를 분리하여 비교적 활성 측정이 용이한 E. coli의 β-galactosidase 유전자인 lac Z유전자와 융합시켜 효모에서 β-galactosidase 활성을 측정한 결과로부터 비교적 강한 promoter인 GAL1-GAL10 promoter와 PHO5 promoter를 선별하였다.2. 다기능 효모 발현 vector의 개발 가. multicloning site의 도입효모에서 나타난 β-galactosidase의 활성 측정 결과로부터 강력한 것으로 판정된 GAL1-GAL10 promoter를 2㎛ plasmid 기원의 multicopy number plasmid인 YEp 352의 multicloning site에 도입하여 외부 유용 활성 물질 유전자의 도입을 용이하게 하고 또 외부 유전자가 효모내에서 multicopy로 존재하게 하여 gene dosage 효과를 높일 수 있도록 하였다. 나. lac Z 유전자의 도입Cloning된 외부 유용 단백질 유전자의 효모내에서의 발현여부를 쉽게 파악할 수 있도록 비교적 활성 측정이 용이한 E. coli의 β-galactosidase 유전자인 lac Z 유전자를 도입하여 유용 단백질과 β-galactosidase와의 융합 단백질을 형성하게 하여 효모로부터 외부 단백질의 발현 여부를 β-galactosidase 활성 측정을 통해 알수 있도록 하였다. 다. leader sequence의 도입도입된 외부 유전자가 효모에서 발현되어 생산된 단백질이 세포내에서 periplasm으로, 또는 배지로 분비될 수 있는 PHO5 유전자의 leader sequence와 α-factor 유전자의 prepro sequence를 도입하여 생산된 외부 유용 단백질을 분비시킬 수 있도록 하였다.3. 다기능 효모 발현 vector를 이용한 인체 lipocortin 유전자의 cloning 및 발현본 연구에서 제조한 GAL1-GAL10 및 PHO5 promoter를 갖는 발현 vector를 이용하여 phospholipase A₂의 활성을 억제하여 인체 소염작용을 나타내는 lipocortin 유전자를 cloning하여 효모에서 효율적으로 발현시켰으며 copy number와 gene dosage 효과에 따른 발현율의 차이를 조사하였다.

Abstract ▼

Development of Multifunctional Yeast Vectors for the Overproduction of Biologically Active Substances.The aim of this project is to develop multifunctional yeast vectors which enable the overproduction of some biologically active substances in yeast cells.Various yeast gene promoter fragments were i

Development of Multifunctional Yeast Vectors for the Overproduction of Biologically Active Substances.The aim of this project is to develop multifunctional yeast vectors which enable the overproduction of some biologically active substances in yeast cells.Various yeast gene promoter fragments were isolated from a number of yeast expression vectors in order to screen out the strong promoters. By fusing the structural gene of lacZ coding for β-galactosidase in E. coli to yeast promoters, the promoter strengths were compared one another as measured β-galactosidase activity. Among yeast promoters tested, it was proven that the GAL1-GAL10 divergent promoter for galactose utilization and the PHO5 promoter for acid phosphatase showed the strongest promoter strengths.Using a multicopy number plasmid YEp352 which was originated from 2㎛ plasmid, a number of different functions were assigned in order to facilitate the expression of cloned genes for biologically active substances. Each of the GAL1-GAL10 and PHO5 promoter was introduced to the upsteram region of multicloning site of YEp352. For the purpose of product secretion, the leader sequences of PHO5 gene and prepro sequence of α-factor were also introduced.In practice, a cloning and expression of human lipocortin gene was tried using the multifunctional yeast expression vectors developed in this study. The human lipocortin is a phospholipase A₂ inhibitory protein and known as a potential anti-inflammatory agent. The synthetic human lipocortin cDNA was cloned into a number of expression vectors under the control of CYC1, GAL1-GAL10 and PHO5 promoters. The expression levels were determined according to the promoter strength and the plasmid copy number. It was observed that the lipocortin gene was able to be expressed under the control of all promoters employed but the highest level of gene expression was achieved under the control of the GAL1-GAL10 promoter. The 2㎛ based multicopy number plasmid showed an increased expression level by 50% compared with ARS based single copy number plasmid.

목차 Contents

• 제1장 서 론...17
• 제2장 실험재료 및 방법...22
• 제1절 사용균주 및 plasmid...22
• 제2절 배 지...24
• 제3절 시약, 효소 및 효소의 반응조건...24
• 제4절 plasmid DNA의 분리방법...25
• 제5절 Transformation...25
• 제6절 yeast total protein의 분리방법...25
• 제7절 Agarose gel 전기영동 및 SDS-PAGE...26
• 제8절 $\beta$-galactosidase의 활성 측정...26
• 제9절 Western blotting...27
• 제3장 결과 및 고찰...29
• 제1절 효모 promoter의 발현특성 및 강도비교...29
• 가. 구성적 발현 promoter...30
• 1. ADH promoter...30
• 2. PGK promoter...30
• 3. $MF_{\alpha}$ promoter...34
• 4. 각 promoter의 강도 비교...34
• 나. 조절적 발현 promoter...35
• 1. GAL1-GAL10 divergent promoter...35
• 2. PHO5 promoter...38
• 제2절 다기능 효모 발현 vector의 개발...42
• 가. multicloning site의 도입...42
• 나. lac Z 유전자의 도입...44
• 다. leader sequence의 도입...44
• 제3절 다기능 효모 발현 vector를 이용한 인체 lipocortin의 cloning 및 발현...44
• 가. 융합단백질의 생산 및 숙주세포의 선정...47
• 나. GAL promoter와 PHO5 promoter의 조절에 의한 인체 lipocortin의 생산...51
• 제4장 결 론...59
• 참고문헌...61