초록 ▼

Yarrowia lipolytica는 비교적 분자량이 큰 단백질을 세포 밖으로대량으로 분비할 수 있는 능력을 가지고 있기 때문에 최근에 유용한 이종단백질을 생산하기위한 숙주로써 특별한 관심을 모으고 있다. 본 연구에서는 Y. lipolytica를 이용하여 부가가치가 높은 유용단백질을 대량생산할 수 있도록 효율적인 발현벡터를 개발하고자 하였으며, superscreting mutant를 획득하여 그 특성을 조사하고자 하였다. 그리고 XPR2promoter의 조절하에 heterologous gene을 발현하는 재조

Yarrowia lipolytica는 비교적 분자량이 큰 단백질을 세포 밖으로대량으로 분비할 수 있는 능력을 가지고 있기 때문에 최근에 유용한 이종단백질을 생산하기위한 숙주로써 특별한 관심을 모으고 있다. 본 연구에서는 Y. lipolytica를 이용하여 부가가치가 높은 유용단백질을 대량생산할 수 있도록 효율적인 발현벡터를 개발하고자 하였으며, superscreting mutant를 획득하여 그 특성을 조사하고자 하였다. 그리고 XPR2promoter의 조절하에 heterologous gene을 발현하는 재조합 Y. lipolytica를 제조하여 발현양상에 대한 연구를 시도하고, Y. lipolytica를 고농도로 배양하는 방법을 개발하여 Y.lipolytica를 이용한 heterologous proteins의 대량생산을 위한 기본 기술을 확립하고자 하였다.숙주세포의 chromosome의 rDNA에 targeted integration을 시도하기 위하여 rDNA를클로닝하고, 표지유전자로는 defective URA3 유전자를 제조하여 multicopy integrationvector를 제조한 결과 2 - 5 copy 정도가 chromosome에 삽입되는 것을 확인할 수 있었다.이종단백질을 과량으로 분비하는 supersecreting mutant를 선별하기 위하여 endoglucanase를 분비하는 재조합 Y. lipolytica에 UV 및 EMS를 처리한 후 endoglucanase의 분비가 약50% 이상 증가된 2 개의 돌연변이주를 선별하였다. 현재 이 두 균주가 정말로supersecreting phenotype을 보이는 돌연변이균주인 지를 확인하기 위하여 humanurokinase의 발현을 시도하고 있다. 이종단백질의 대량생산에 필요한 Y. lipolytica의 고농도 배양에 관한 실험을 수행하기 위하여 탄소원으로는 glycerol, 질소원으로는 ammoniumsulfate, 그리고 phosphate, magnesium, trace elements 및 vitamin solution을 첨가하여 배양배지를 제조하였다. 2.5, 5, 7.5, 10, 그리고 15%의 glycerol을 첨가한 배지에서 발효조를사용하여 회분배양을 수행한 결과 Y. lipolytica는 15%의 glycerol이 첨가된 배지에서도 생장이 가능하다는 것을 알 수 있었다. 5% 이하의 glycerol 농도를 유지하면서 유가식 배양을 실시한 결과 약 80 시간 만에 건체중량 90 g/L 까지 배양할 수 있었다. Y. lipolytica는15% glycerol이 첨가된 배지에서도 생장이 가능하나 lag phase가 매우 길어지며 기질당biomass의 yield가 낮은데 yeast extract를 첨가하면 이러한 문제를 극복할 수 있다는 결과를 얻었다. Yeast extract의 효과를 좀더 자세히 알아보기 위하여 0.1%에서 0.5%까지의yeast extract를 첨가한 배지에서 회분배양으로 Y. lipolytica를 배양한 결과 0.3% yeastextract가 첨가된 배지에서 건체중량 82 g/l 까지 얻을 수 있었다. 재조합 Y. lipolytica 균주들의 생장과 EGI 발현양상을 살펴보기 위하여 2 개의 발효조를 사용하여 growth stage와production stage를 분리하여 배양하는 2 단계 배양을 수행하였다. EGI의 activity를 건체중량당 unit으로 환산하였을 경우 ARS-based 벡터인 pAUXEGI을 가진 균주에서 singlecopy로 integration되는 pXCSIn(His)를 가진 균주보다 약 2 배가 많이 분비되는 결과를 얻었다. 본 연구를 통하여 얻은 결과들은 heterologous proteins을 생산할 수 있는 새로운Y. lipolytica 숙주-벡터 시스템을 개발하고 활용하는데 많은 도움을 줄 것으로 기대된다.

Abstract ▼

Recently, Yarrowia lipolytica has received special attention as apotential host for production of heterologous proteins due to its ability to secrete highlevels of large proteins such as an alkaline extracelluar protease, several acid proteases,and an RNase. Therefore, we proposed to develo

Recently, Yarrowia lipolytica has received special attention as apotential host for production of heterologous proteins due to its ability to secrete highlevels of large proteins such as an alkaline extracelluar protease, several acid proteases,and an RNase. Therefore, we proposed to develop Y. lipolytica heterologous geneexpression systems by constructing multicoy integration vectors and isolating andcharacterizing better heterologous protein secretors. We also tried to establish basicrequirements for overproduction of heterologous proteins in Y. lipolytica by studing thegene expression controlled by the XPR2 promoter and developing high cell densityculture technique.To develop a multicopy integration vector system, P-type ribosomal DNA wascloned from Y. lipolytica and a defective URA3 gene as a selection marker wasconstructed. After transformation of the integration vector into Y. lipolytica, copynumber and stability were analyzed by Southern hybridization. The vector was foundto be present in less than 5 copies per cell and was stably maintained during growth innon-selective media. To isolate better protein secretors, Y. lipolytica expressing theTrichoderma reesei endoglucanase I gene was treated with UV or EMS. Amongmutant strains which secreted endoglucanase I better than the parental strain on agarplates containing carboxymethylcellulose, two mutants were found to secrete moreendoglucanase I by 50% than the parental strain in liquid media. A new culturemedium composed of glycerol, ammonium sulfate, phosphate, magnesium, trace elements,and vitamin solution was formulated to cultivate Y. lipolytica to high cell density. Itwas found that Y. lipolytica could grow in 15% glycerol media when batch cultures in afermentor were carried out with the developed medium containing 2.5, 5, 7.5, 10, and15% glycerol. In a fed-batch culture in which glycerol concentration was maintainedbelow 5%, Y. lipolytica was grown to 90 g/L in 80 hours. Althogh Y. lipolytica cangrow in a 15% glycerol medium, it showed a long lag phase and a low biomass yieldunder the culture condition. It was found that the long lag phase could besignificantly reduced by adding yeast extract to the 15% glycerol medium and Y.lipolytica coud be cultivated up to 82 g/L in a simple batch culture when 0.3% yeastextract was added to the 15% glycerol medium. To investigate the growth and geneexpression patterns of recombinant Y. lipolytica producing endoglucase I, 2 stagecultures were carried out using two separate fermentors. The fermentation resultsrevealed that the secretion of endoglucanase I by the recombinant strain carrying theARS-based vector, pAUSEGI, was about 2 times higher than that of the strain carryingthe single copy integration vector, pXCSIn(His). The results obtained in this researchshould be valuable materials and information in realizing industrial application ofrecombinant Y. lipolytica for overproduction of phamaceutically important proteins

목차 Contents

• 목차...6
• I. 서론...7
• II. 연구방법 및 이론...9
• III. 결과 및 고찰...15
• 1. Multicopy intergration vector의 제조...15
• 2. Supersecreting mutant의 선별...28
• 3. Y. lipolytica의 고농도 배양...30
• 4. 재조합 Y. lipolytica의 제조 및 배양...33
• IV. 결 론...40
• V. 참고문헌...41
• 연구수행관련 논문발표목록서...44
• 자체평가서...45