초록 ▼

Ⅰ. 제 목 고 기능ㆍ고 부가가치 펩타이드성 의약품 창출을 통한 펩타이드 공학 기술의 강화 Ⅱ. 연구개발의 목적 및 필요성 1. 연구 개발 목적 단백질에서 유래된 유용 펩타이드의 개발 모델로 HIV-1의 gp41 단백질의 서열중 항 HIV-1 활성이 높은 C 말단 heptad 반복서열 변형시켜, 강력한 항 HIV-1 활성을 지니는 펩타이드로 개량하고, 짧은 펩타이드성 호르몬인 α-MSH 펩타이드를 변형시켜, 비만 조절 수용체인 melanocortin receptor 4 (MC-4R)에 대한 특이성 및 활

Ⅰ. 제 목 고 기능ㆍ고 부가가치 펩타이드성 의약품 창출을 통한 펩타이드 공학 기술의 강화 Ⅱ. 연구개발의 목적 및 필요성 1. 연구 개발 목적 단백질에서 유래된 유용 펩타이드의 개발 모델로 HIV-1의 gp41 단백질의 서열중 항 HIV-1 활성이 높은 C 말단 heptad 반복서열 변형시켜, 강력한 항 HIV-1 활성을 지니는 펩타이드로 개량하고, 짧은 펩타이드성 호르몬인 α-MSH 펩타이드를 변형시켜, 비만 조절 수용체인 melanocortin receptor 4 (MC-4R)에 대한 특이성 및 활성이 증진된 펩타이드로 개량하고 이를 비만 억제제 개발에 이용하고자 한다. 2. 연구개발의 필요성 (1) 기술적 측면 펩타이드는 단백질에 비해 크기가 작아 화학합성법으로 제조할 수 있고, 다양한 변형체를 쉽게 만들 수 있는 특징이 있어 신기능성 물질 창출에 매우 커다란 장점을 갖고 있다. 본 기술은 펩타이드 합성 및 정제, 단백질 서열 및 구조에서 유래된 기능성 펩타이드 설계, 펩타이드 구조 및 기능 분석, 활성 및 특이성이 증진된 기능성 펩타이드 설계, 펩타이드의 생체내에서 안정화 및 목표 부위로의 전달, 기능성 펩타이드를 흉내내는 펩타이드 모방형 물질 (peptidomimetics)의 설계 기술 등을 포함하는 기술로, 모든 내용이 중요하나 이중 핵심적인 사항은 활성 및 특이성이 높은 기능성 펩타이드의 합성 및 설계기술을 들 수 있다. 펩타이드 공학 기술을 이용하여, 활성이 증진된 펩타이드 약물 개발시 후보물질들로는 기존 자연계 펩타이드들을 이용하거나, 단백질 서열로부터 유래된 펩타이드를 이용할 수 있다. 본 연구에서는 ① 전 세계적으로 큰 문제로 대두되고 있는 후천성 면역결핍 증후군 (AIDS)을 일으키는 HIV gp41 coiled coil 구조를 대상으로 이 단백질 서열에서 항 HIV 활성이 있는 펩타이드를 설계하고 구조ㆍ활성 분석등의 펩타이드 공학 기술을 이용하여, 항 HIV 활성이 증진된 펩타이드로 개량할 예정이다. ② melanocortin 수용체 (MC-R)에 작용하여 비만을 억제하고 피부색을 조절한다고 알려진 펩타이드인 α-melanocyte stimulating hormone (α-MSH)을 비만 억제와 관련된 melanocortin 수용체 4에 대한 특이성을 높이고, 약물 전달이 용이하고, 생체 내에서 stability가 높은 peptidomimetics로 펩타이드 공학 기술을 이용하여 개량할 예정이다. 따라서 본 연구는 펩타이드 의약품 및 모방형 펩타이드 개발에 매우 유용한 기술이 될 것이다. 본 연구의 수행을 위해서는 앞에서 언급한 모든 펩타이드 공학 기술을 이용하여야 하며, 특히 국내에서는 미약한 분야로 알려진 펩타이드 합성분야, 설계분야, 약물전달체계 분야 및 peptidomimetics 분야 등의 기술을 확보하거나 강화시킬 수 있을 것으로 여겨진다. (2) 경제. 산업적 측면 펩타이드성 신물질은 그 효용범위가 광대하며 그에 따르는 잠재적 시장성은 무한하다고 할 수 있다. 본 연구에서 다루려고 하는 항 HIV 펩타이드 제재 및 비만억제제의 개발에 따른 경제 산업적인 효과를 제시하면 다음과 같다. ① HIV의 경우, HIV에 의해 일어나는 후천성 면역결핍증 (AIDS)은 현재 사망률이 매우 높고 완치가 힘든 질병이다. UNAIDS 보고서에 의하면 1999년말까지 전세계적으로 HIV 보균자 수는 3,400만명 이상으로 추산되며, 미국에서만 매년 인구 100,000 명당 40명꼴로 HIV와 관련되어 사망하고 있으며, 아프리카에서는 이 보다 훨씬 심각한 수준이다. 현재 국내에는 2,000 명가량의 보균자가 있다고 알려져 있으나, 실제로는 10,000 명이상의 보균자가 있을 것으로 여겨진다. 현재 치료제 시장규모는 전 세계적으로 년간 500억 달러 이상으로 추정된다. 따라서 이에 대한 치료 약물의 개발은 경제적인 부가가치가 매우 높고, 수출 증대 효과가 매우 클것으로 여겨위가 전세계적이다. 미국의 경우 1988년에 25%이던 비만인구가 많은 노력에도 불구하고 10년만인 98년에 32%로 증가하였고, 어린이의 경우는 최근 16년 사이에 40%의 비만 발생률의 증가를 보였다. 상대적으로 비만이 큰 문제가 되지 않고 있던 아시아도 생활수준이 향상되고 생활습관이 서구화되면서 비만 인구가 증가세를 보이고 있다. 또한 당뇨병환자 80%, 심장병환자의 70% 그리고 유방암 환자의 50%가 비만이 발병원인이 된다는 조사 내용으로 미루어 볼 때, 비만의 심각성이 매우 크다. 따라서 현재 세계적으로 비만치료를 위한 많은 의료경비가 지출되고 있으나 뚜렷한 성과가 없으며, 허가 받았거나 개발중인 시약들도 여러 부작용이 많이 나타나고 있기 때문에 새로운 비만치료제의 개발이 시급한 실정이다. 현재 세계의 비만관련시장은 약 연간 2000억 달러로 계속 늘어나고 있으며 직접의료비만도 약700억 달러에 이른다. 따라서 5-10%의 시장점유율만 생각해도 최소한 35억-70억 달러의 상품가치가 있다. 3. 사회. 문화적 측면 기존의 의약품, 식품첨가물 등의 생리활성조절물질들은 대부분 화학물질을 기본으로 한 것으로, 그 효과가 탁월하긴 하였으나 부작용, 환경오염 등의 심각성이 드러나면서 좀 더 생명 친화적이고 특이성이 높은 생리활성조절물질의 개발이 필요하게 되었고, 이러한 요구의 많은 부분을 생리활성 특이성을 갖는 펩타이드 및 이의 변이체로 해결할 수 있을 것으로 기대되며 이를 수행하기 위한 펩타이드 공학기술은 그 핵심에 있다고 하겠다. 또한 이 연구의 target이 되고 있는 AIDS 및 비만은 현재 사회적으로 커다란 문제가 되고 있는 만큼 이 연구는 사회ㆍ문화적인 측면에서도 대단히 중요하다. Ⅲ. 연구개발의 내용 및 범위 1.gp41 단백질에서 유래된 항 HIV 펩타이드의 개량 연구 (1) HIV-1 gp41 유래 길이가 긴 펩타이드 (30mer 이상)의 소량 다종류 동시 합성법의 최적화 -합성 효율을 높이기 위한 펩타이드 합성-resin 혼합을 극대화 방법 확립 -폐액 배출 효율을 증진시키도록 시스템 설계 -Cross contamination 억제시키기 위한 방법 고안 (2) Live HIV-1을 직접 사용하지 않고도 항 HIV-1의 활성을 측정할 수 있는 분석 방법 개발 - HIV-1/MuLV pseudotyped 바이러스를 제조를 위한 HIV-1 env 유전자 재조합 및 이를 TELCeB6 세포에 transfection 시켜 pseudotyped 바이러스 제조. - Pseudotyped 바이러스를 이용한 항 HIV-1 펩타이드의 활성 분석. - HIV-1 env 유전자 및 숙주 수용체를 발현하는 백신니아 바이러스와 이를 정량적으로 측정할 수 있는 reporter 유전자 시스템을 이용한 펩타이드의 항 HIV-1 활성 측정. (3) 다양한 HIV-1 strain들의 gp41의 coiled coil 구조의 C-말단 펩타이드에서 유래된 항 HIV-1 펩타이드의 설계 - 한국인에서 가장 많이 나타나는 clade B형의 HIV-1 strain들의 서열 및 각 clade들의 대표형에서 유래된 C34 펩타이드의 설계. (4) HIV-1 gp41의 C-말단 유래 펩타이드들의 아미노산 치환에 의한 항 HIV 활성증진 연구 - 활성이 높은 HIV-1 89.6 strain에서 유래된 펩타이드에서 N-말단 capping dC-C disulfide 결합도입 등에 의한 활성 증진 연구 시행. (5) HIV-1 89.6 strain 유래 펩타이드에서 활성 증가에 중요한 부위 mapping - Chimeric 펩타이드, T20 펩타이드, 길이가 짧은 펩타이드들 및 이에 대한 치환체를 이용하여 활성 증가에 중요한 부위 mapping (6) HIV-1 gp41 펩타이드들의 2차 구조 분석 - CD를 이용한 trifluoroethanol 존재 유무에 따른 HIV-1 gp41 펩타이드의 2차 구조 분석. 2. α-MSH의 개량을 통한 비만 억제제 도출에 관한 연구 (1) Melanocortin 수용체 결합력 측정법 및 생물활성 측정법nocortin 수용체 아형 1,3,4,5 의 유전자를 발현하는 transfectant의 확보 및 이들을 이용한 수용체 결합력 측정 및 생물활성 측정을 위한 high throughput screening system 의 확보 (2) α-MSH에 대한 펩타이드성 유사체들의 peptidomimetics 기법을 이용한 설계 및 합성 - 활성이 증진된 α-MSH유래 서열 및 구조 변이체들의 고안및 합성,정제 (3) α-MSH 유사체들의 melanocortin수용체들에 대한 결합특이성 및 cAMP 활성 측정 (4) α-MSH 유사체 펩타이드의 2차, 3차 구조분석을 통한 구조와 수용체 선택성과의 상관관계 분석 - α-MSH 구조변이체들의 활성과 구조 정보및 melanocortin수용체들의 구조정보에 대한 검토를 통한 수용체 선택성과 구조의 상관 관계분석 (5) 항-MC-4R 항체의 제조 및 이를 이용한 각종 세포들의 MC-4R 발현 검토 - MC-4R의 항원부위선택 및 이를 이용한 항-MC-4R 항체의 제조 및 이를 이용한 뇌세포유래 세포주들에서의 MC-4R 발현 검토 Ⅳ. 연구개발결과 1. gp41 단백질에서 유래된 항 HIV 펩타이드의 개량 연구 (1) 길이가 긴 펩타이드 합성 - 본 연구자들이 개량한 시스템으로 길이가 긴 펩타이드들(28-38 mer)을 40-70%의 순도로 합성이 가능하였고, HPLC 정제 후 모두 90% 이상의 순도로 정제가 가능하였다. 특히 개량된 장치는 합성 시간 단축이 가능하였고, cross contamination을 억제함으로서 합성 수율을 높일 수가 있었다. (2) 항 HIV-1 활성 분석 시스템 확립 - 본 연구에서는 안전하여 일반 실험실에서도 사용할 수 있는 HIV-1/MuLV 위형바이러스들의 제조를 시도하였다. - HIV-1 env 유전자가 MuLV particle에 packaging 되기 위하여 144 C-말단 절단 및 rev 유전자의 발현이 요구된다. 본 연구에서는 CMV promotor하에서 다양한 HIV-1 env 유전자 도입후 rev 단백질 및 C-말단 절단 표면단백질을 만들어 지는 벡터 및 발현 유전자를 제조하였다. - 제조된 유전자를 TELCeB6 세포에 transfection 시킨 결과 숙주세포 (HOS-CD4-CXCR4 및 -CCR5)에 감염성이 있는 pseudotyped 바이러스가 만들어졌다. - 본 연구에서는 또한 본 연구자가 개발한 SEAP 유전자를 사용하는 세포 융합법을 이용하여 정량적으로 HIV-1 표면단백질과 숙주수용체간의 세포 융합을 측정하는 방법을 확립하였다. (3) C34 유래 펩타이드의 항 HIV-1 활성 - HIV-1/MuLV 위형바이러스 및 세포 융합법에 의하여 펩타이드의 항 HIV-1 활성을 측정한 결과 Clade B형중 HIV-1 89.6 strain에서 유래된 C34-89.6 펩타이드가 다른 HIV-1 strain C34 펩타이드들보다 항 HIV-1 활성 2-25배 높았으며, 다른 clade형의 대표 서열과 비교하여도 10배이상 활성이 높았다. - C34-89.6중 항 HIV-1 활성 증가에 필수적인 부위를 찾기 위하여 chimeric 펩타이드, T20 펩타이드 및 C28 펩타이드들을 만들어 분석한 결과, C34-89.6의 C-말단이 활성 증진에 중요하였다. - N-말단 hydrophobic capping은 C34 및 C34의 C말단이 절단된 펩타이드 경우 매우 중요한 역할을 하였는데 이는 free amine 기가 이 부위 hydrophobic interaction을 억제하기 때문이라 여겨진다. - dC 및 C를 각각 i 및 i+3 위치에 도입하여 constrained force를 주어 α - helical 구조를 안정화시키려고 시도한 결과, N-말단에 도입한 경우 일부 활성을 증가시켰으나 중간부위 및 C-말단에 도입한 경우에는 오히려 활성을 매우 감소시키었다. (4) 항 HIV-1 펩타이드 구조와 항 HIV-1 활성간의 상관 관계 분석 - CD에 의한 펩타이드의 2차 구조와 항 HIV-1과의 상관관계를 분석한 결과 C34 펩타이드와 항 HIV-1의 활성간에는 유의한 상관관계가 없었으나 길이가 짧은 C28 펩타이드의 경우에는 상관관계가 매우 높게 나타났다. dC-C disulfide를 도입한 경우 활성이 높아지는 경우에는 α-helicity가 거의 비슷하였으나, 활성이 떨어진 경우에는 모두 α-helicity가 감소되었다. 2.α-MSH의 개량을 통한 비만 억제제 도출에 관한 연구 (1) 기능성 펩타이드의 합성 및 관련기술 확보 - 본 실험실에서는 보오트형 다종류 펩타이드 합성기로 Fmoc chemistry에 의한 펩타이드 합성을 실시하였다. 종전에는 자연 유래 아미노산을 이용한 선형 펩타이드 제조를 주로 실시하였는데, 펩타이드의 생리활성 기능을 향상시키기 위한 방법으로 stereoisomer인 D-형의 아미노산 및 Phg(phenylglycine), Cha(cyclohexylalanine), Tha(Thienylalanine)등의 특수구조를 갖는 펩타이드들을 제조하였고, N-말단의 아세틸화, C-말단의 아미드화 등의 부가적인 구조를 도입하는 방법을 확립하였다. 또한 작은 펩타이드에 대해 구조를 유지하기 위해 도입할 수 있는 방법으로는 선형 펩타이드의 양 말단에 시스테인기를 도입하고 선형펩타이드 완성 후 설파히드릴기(-SH)의 산화반응을 유도하는 방법을 이용하였다. (2) 기능성 펩타이드의 활성 측정을 위한 시스템의 확보 - 멜라노코틴 수용체들은 G-protein수용체에 속하며 현재까지 모두 5가지 종류가 밝혀져 클론닝되어 있다. 멜라노코틴 펩타이드들은 이들 수용체들에 대하여 조금씩 다른 친화력을 갖고 작용하지만 교차 반응성이 크기 때문에 본 과제에서 설정하였듯이 다른 부수적인 작용없이 비만을 조절하는 유도체를 확보하기 위해서는 비만을 조절하는 아형4 수용체에 대한 결합 및 생리활성 조절능의 확인 뿐 아니라 다른 멜라노코틴 수용체 아형들에 대한 반응정도를 확인하여 가능한 한 MC4R에만 작용할 수 있는 펩타이드 유도체를 고안해내야 한다. 이를 위해서 본 연구에서는 MC4R을 발현하는 세포주 뿐 아니라 다른 아형의 수용체를 발현하는 세포주를 확보하여 실험하였다. 수용체의 기능을 동일한 조건에서 시험하기 위해서는 각각의 수용체를 HEK 세포에 transfection 하여 사용하였다. (3) 멜라노코틴 수용체들에 대한 결합능력 분석 - 멜라노코틴 수용체에 대한 리간드 펩타이드들의 결합력을 확인하기 위해서 이미 이들 수용체에 대하여 결합능이 잘 알려져 있는 125I로 표지화된 NDP-MSH에 대한 경쟁적 결합억제정도를 측정하였다. 또한 본 연구에서는 여러 가지 펩타이드 유도체들을 동시에 시험하기 위해서 filter가 부착된 micro-well plate를 이용한 high-throughput screening system을 확보하여 이를 실시하였다. (4) 멜라노코틴 수용체의 신호전달기능 측정 - 멜라노코틴 수용체의 신호전달기능을 시험하기 위하여 이들 수용체를 발현하는 세포들에 대하여 시험대상 펩타이드들을 처리하고 이 때 생성되는 세포내 cyclic AMP의 양을 정량하였다. 신호전달물질에 대한 실험도 수용체 결합력측정법의 경우처럼 기존의 assay방법을 HTS(high-throughput screening) 시스템으로 변형하여 실시하였다. (5) 기능성 펩타이드의 설계 및 이들의 효능 측정 :α-MSH를 변형한 기능성 펩타이드의 설계로 얻은 결과들은 다음과 같다. - Antagonist인 HS024의 변이체로 MC4R에 대해서 agonist의 특성을 갖는 펩타이드인 ob-4를 확보하였다. - 멜라노코틴 수용체 3에 대해서는 agonist로, 멜라노코틴 수용체 4에 대해서는 antagonist로 선별 작용하는 펩타이드인 ob-8을 확보하였다. - C-terminal sequence extension으로 hMC1R, hMC3R, hMC4R에 대한 cAMP 반응성을 증진시켰으며 이들은 멜라노코틴 수??였다. - HS024에서 Nle를 제거한 펩타이드 ob-9는 hMC3R, hMC4R에 대해 10nM이하의 EC50 값 범위에서 작용하는 좋은 agonist임이 확인되었다. (6) 항-MC-4R 항체의 제조 - MC-4R의 구조를 구조분석 software들을 이용하여 분석하고 이 중 MC-4R의 agonist인 α-MSH의 결합 부위라고 알려져 있으며 동시에 MC-4R에 가장 특이적인 제 1번 loop(106-118 a.a.)를 항체의 제조시 필요한 면역원으로 결정하였다. 이 부분에 대해 항체를 제조하기 위해서 우선 이를 pFliTrxTM 벡터에 클로닝하여 재조합 단백질의 형태로 제조하였고, 마우스에 주사하여 폴리클로날 항체를 제조하였다. (7) MC-4R로 형질 전환된 세포에서의 MC-4R의 발현 및 발현정도 조사 - 제조된 항체가 재조합 단백질 형태로서의 MC-4R exoloop 1을 인식할 뿐 만 아니라, 실제 세포표면에서 발현되고 있는 상태로의 MC-4R의 발현을 탐지할 수 있는지를 확인하기 위하여 hMC-4R 발현 세포주에 대하여 폴리클로날 항체를 이용한 Western blot과 flow cytometry를 수행하였다. 또한 다른 아형 수용체 특히, MC-3R과 차별성을 지니고 있는지를 확인하기 위하여 인간 MC-3R 발현세포주에 대하여 비교 실험을 실시하여 제조한 항체의 hMC-4R 에 대한 특이 반응성을 확인하였다. (8) 신경세포유래 MC-4R의 발현 세포주의 확보 와 항체를 이용한 MC-4R 발현의 동정 - 인간 뇌세포 유래 세포주인 A172, SK-N-SH, SK-N-MC, NCI-H1915와 U-87-MG가 세포표면으로 MC-4R을 발현시키는 지의 여부를 flow cytometry로 검사하였고, 그 결과 A172이 MC-4R을 세포표면으로 발현함을 확인하였다. 이를 다시 확인하기 위하여 RT-PCR 분석을 실시하여 동일한 결과를 확인하였다. Ⅴ. 연구 개발 결과의 활용계획 1. 펩타이드 합성 본 연구실에서 개발한 펩타이드 합성 시스템은 벤처기업인 펩트론에 기술이전하여 이미 상용화하였으며, 본 연구에서 개량한 시스템도 벤처기업으로 이전 수탁 합성 등에 이용할 예정이다. 2. gp41 단백질에서 유래된 항 HIV 펩타이드의 개량 연구 본 연구에서 항 HIV-1 활성이 증진을 위하여 사용된 방법들은 후에 된 앞으로 활성이 증진된 펩타이드 개발에 이용할 수 있을 것이다. 그리고 활성이 높은 HIV-1 89.6 유래 펩타이드들은 HIV-1 치료제 개발에 사용할 수 있을 것이다. 또한 본 연구에서 개발된 HIV-1 유전자 도입 및 발현용 벡터 (pcKCX)는 HIV-1 표면 단백질의 숙주 tropism, co-receptor usage 연구 등에 유용하게 쓰일 수 있고, 이를 이용하여 얻어진 pseudotyped 바이러스들은 앞으로 항 HIV-1 약물 탐색에 매우 유용하게 이용될 수 있을 것이라 사려된다. 또한 biotinylated 펩타이드들은 coiled coil 구조에 결합을 억제하는 물질 탐색에 쓰일 수 있을 것이라 사려된다. 또한 dC-C disulfide 결합 형성에 의한 펩타이드에 constrined force를 주는 방법들도 기능성 펩타이드 물질 개발에 유용하게 이용되리라 여겨진다. 3. α-MSH의 개량을 통한 비만 억제제 도출에 관한 연구 멜라노코틴 수용체에 대한 선택적 반응성이 있는 펩타이드성 유도체들의 합성 및 이들의 효능검사를 통해 기존의 화합물과는 다른 형태의 리간드들을 제안할 수 있었으며, 이들은 수용체조절이 가능한 약제 개발의 선도물질로서의 역할을 하게 될 것이다. 또한 이들은 멜라노코틴 수용체의 생리활성을 연구하는데 유용한 도구로 이용될 수 있을 것이다. 4. 멜라노코틴 수용체 아형 4에 대한 특이적 항체 멜라노코틴 수용체는 여러 가지 아형으로 존재하고 이들의 단백질 서열에 유사성이 많아 이들을 개별적으로 구분해내는 항체의 제조가 어려웠다. 본 연구에서는 항체를 제조에 필요한 특정부위만을 구조적 항원으로 발현하고, 또는 이에 해당하는 구조형 펩타이드를 제조하여 그들에 대한 특이 항체를 획득하는 실험방법을 고안하였고, 이를 이용하여 멜라노코틴 수용체 아형 4에 대한 특이적 항체를 획득할 수 있었다. 이는 수용체의 특성 연구에 중요한 도구로 활용될 수 있을 것이다. 또한 멜라노코틴 수용체 체조를 위해 사용한 방법은 다른 종류의 구조적인 항원부위에 대한 항체를 제조하는 방법으로도 적용될 수 있을 것이다.

Abstract ▼

Peptides have been reported to involve in various biological control systems. They can act as hormones, growth factors, neurotransmitters, host defenses, and so on. Recently, peptides are considered to be useful for developing target specific drugs. Moreover, they can be easily synthesized by the c

Peptides have been reported to involve in various biological control systems. They can act as hormones, growth factors, neurotransmitters, host defenses, and so on. Recently, peptides are considered to be useful for developing target specific drugs. Moreover, they can be easily synthesized by the chemical methods. Peptide engineering techniques involve in the ones such as peptide synthesis, analysis of structure-function relationship, design of peptide with higher activity and specificity, peptide delivery to the target organ and peptidomimetics. The candidate peptides for peptide engineering are derived from the natural peptides or the peptide sequences in proteins. In this study, we tried to develope potent anti-HIV-1 peptides derived from the HIV-1 gp41 coied coil sequences and to develope anti-obesity peptides specific to the melanocortin receptor type 4 (MC-4R) derived from α melanocortin stimulating hormone (α-MSH). To determine anti-HIV-1 activity without using live HIV-1, a vector system (pcKCX) was constructed and the foreign HIV-1 env gene was cloned into the vector. The HIV-1/MuLV peudotyped viruses was generated by transfected the recombinant plasmid into TELCeB6 cells. The cell fusion system using recombinant vaccinia viruses was also used for the assay. The peptides derived from the gp41 coiled coil sequence, especially C-terminal region sequence, have been reported to have potent anti-HIV-1 activities. C34-LAI derived from the gp41 sequence 628-661 elicited potent anti-HIV-1 activity at the nM range against the HIV-1 IIIB strain. In this study, we analyzed the anti-HIV-1 activities of various C34 peptides derived from clade B HIV-1 strains. Interestingly, the C34 peptide (C34-89.6) derived from the HIV-1 89.6 strain was found to have the most potent activity (2.5 to 25 higher than other peptides) against all the HIV-1 strains tested. In oder to identify the critical region of C34-89.6 related to increase of anti-HIV-1 activity, the chimeric C34 peptides between 89.6 and LAI strains were synthesized. The N-terminal half of C34-89.6 is more acidic (-3) than that of C34-LAI, whereas its C-terminal half is more basic (+3) than that of C34-LAI. Interestingly, the C-terminal half of C34-89.6 was found to be more important. According to the X-ray crystallography data, the N-terminal hydrophobic residue of C34 has been reported to bind the pocket region of the N36 triple structure and this binding is important for anti-HIV-1 activity. Unlike the N-terminal region of C34, the hydrogen bond is important for the interaction between the C-peptide and the N-peptide. Therefore the highest activity of C34-89.6 might be correlated its the higher hydrogen bond forming potency to the N-peptide. The impotance of the C34-89.6 C-terminal region was also observed in T20 peptides. The T20 (DP178) peptide contains the C-terminal half of the C34 peptide. T20-LAI has been studied for the phase III clinical trial. T20-89.6 also showed 3 to 5 times higher activity T20-LAI used previously. We synthesized C28 peptides with 6 mer deletion of C34 peptides. C28-89.6C with 6 mer deletion at the N-terminus of C34-89.6 showed higher activity than other C28-89.6 peptides, C28-89.6A and C28-89.6B with 6 mer deletion at C-terminus and 3 mer deletions at both N-and C-terminus of C34-89.6, respectively. However, C28-LAI-C with 6 mer deletion at the N-terminus of C34-LAI elicited little or no anti-HIV-1 activity, also supporting the importance of the C-terminal half of C34-89.6. We also synthesized the peptides with the N-terminal hydrophobic capping. The anti-HIV-1 activities of the N-terminal modified peptides with the motif for binding to the hydrophobic groove of N36 dramatically increased. The acetylated and biotinylated peptides of C34-89.6 and C34-LAI showed similar activities, and elicited much higher anti-HIV-1 activities then their parental types. Moreover, Ac-C28-89.6A showed high anti-HIV-1 activity (approximately 45 nM), even though C28-89.6 had little or no anti-HIV-1 activity. This results may be caused by the effect of their free Nα-amine group. According to the X-ray crystallography, the tryptophan residues of the C-peptide and the N-peptide around the Nα-amine group are closed by hydrophobic interaction, but the free Nα-amine group may be interfare the interaction. Therefore those N-terminal hydrophobic modifications was considered to abolish the inhibitory effect. The CD spectra of the long anti-HIV-1 peptides (C34 and T20) were found not to be correlated with their anti-HIV-1 activities, whereas the C28 peptides were correlated well to theirs anti-HIV-1 activity indicating that the α-helical tendency of the C28 peptides may be important for their anti-HIV-1 activity. The peptides introduced the dC-C disulfide bonds showed various α-helical propensities according to their disulfide bond locations. The disulfide bond at the N-terminal region showed little or no change their overall α-helical propensities, whereas the disulfide bonds at the middle or C-terminal regions decrease their α-helical propensities. The α-helical propensities were also correlated well with their anti-HIV-1 activities. The results suggest that the dC-C disulfide bond at positions i and i+3, repectively, (1) may not be enough to form a proper α-helical structure, (2) the dC may disrupt the α-helical structure. Since the hydrogen bonds are critical for the α-helical structure and the interaction of the C34 C-terminus with the N36 peptide, the dC-C disulfide bonds at this region may be related to unstabilizing those structures by disrupting the hydrogen bonds. Obesity is controlled by MC4R receptor and they are expressed mainly in hypothalamus in brain. Other melanocortin receptors, MC1R, MC3R and MC5R, are expressed in other organ or tissues and their biological functions are not related to obesity. Alhough melanocortin receptors are different in their distribution and function, their protein sequences have high homology, which results in cross-reactivity of most melanotropic peptides on these receptors. The cross-reactivity of ligands might result in the side effects on their application. So, for the development of anti-obesity peptides specific for the melanocortin receptor type 4 (MC-4R), various structural varients derived from α-melanocortin stimulating hormone (α-MSH) were synthesized and compared their activities on various melanocortin receptors to select the specific ligand. N-terminal or C-terminal sequence varients with the core sequence of the a-MSH, cyclized peptides with disulfide bonds to maintain structural constraints of active core structure, structural varients with non-natural amino acids were designed and synthesized. The efficacy of the ligand was determined by ligand binding assay and cAMP-generating assay with melanocortin receptor-transfected cells(MC1R, MC3R, MC4R, MC5R). At first, we searched the most selective ligand for the human MC4R among the already-reported. HS024 was reported as the most selective ligand for the MC4R, but it is an antagonist. So we modified d-Nal residue of the HS024 at the core region to d-Phe(ob-4) to change the ligand property. As expected, ob-4(Ac-Cys-Nle-Arg-His-DPhe-Arg-Trp-Gly-Cys-NH2) have been acted as agonist with the specificity for the MC4R. Peptides with N- or C-terminal sequence extension of the ob-4 were prepared and assayed their activities. C-terminal sequence extension resulted in the increase of the agonistic effect of ob-4 on the MC1R, MC3R, and MC4R. It did not act on the MC5R. And ob-9, Ac-Cys-Arg-His-DPhe-Arg-Trp-Gly-Cys-NH2, was identified as a good agonist for the MC3R and MC4R with its EC50 value below 10nM. . The melanocortin-4 receptor (MC-4R) is a 7-transmembrane protein, which is involved in the central regulation of appetite and obesity. Despite the great interest in this protein, tools for detecting this molecule (as expressed on the cell surface in its native state) have been unavailable. Radioactive- or otherwise labeled ligands showed low receptor specificity to this particular melanocortin receptor isotype. Also, the antibodies were only available for epitopes that were displayed in the cytoplasm. To produce antibodies that enable the detection of this receptor (as expressed on the cell surface without disruption of the target cells), a candidate epitope was selected from the extracellular domains by a computer-aided analysis of the IC-4R secondary structure. This particular region was then recombinantly expressed in E. coli. Immunization of BALB/c mice with the recombinant proteins induced a specific immune reaction, which resulted in the production of MC-4R-specific antibodies. Enzyme-linked immunosorbent assays confirmed the specificity of these antibodies. To examine whether this tool also reacts with native cell surface-displayed MC-4R, HEK-293 cells were transfected with the human MC-4R cDNA. They were analyzed with these antibodies using Western blot and flow cytometry. Specificity and exclusion of cross-reactivity of these antibodies to other MC receptors were further confirmed by an immunofluorescence analysis of the HEK-293 cells that were transfected with other MC receptor isotypes. It is evident that with the availability of this tool, studies on the cell- and tissue-specificity, as well as the regulation mechanism of the MC-4 receptor, will be largely facilitated. Various cell lines derived from human brain, A172, SK-N-SH, SK-N-MC, NCI-H1915, and U-87-MG, were analysed with these antibodies using flow cytometry. A172 cell line was shown to express MC4R and this result was confirmed by RT-PCR.

목차 Contents

• 제출문 ...1
• 요약문 ...2
• SUMMARY ...11
• CONTENTS ...15
• 목차 ...17
• 제 1 장. 서 론...19
• 제 1 절. 연구개발의 배경...19
• 제 2 절. 연구개발의 경제？사회？기술적 중요성...20
• 제 2 장. 국내외 기술개발 현황...23
• 제 1 절. 국외 현황...23
• 제 2 절. 국내 현황...25
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과...27
• 제 1 절. 연구개발의 최종목표 및 단계별/연차별 연구개발 목표 및 내용...29
• 제 2 절. 연구 추진 전략 및 방법...29
• 1. gp41 단백질에서 유래된 항 H IV 펩타이드의 개량 연구...29
• 가. 항 H IV-1 펩타이드의 합성...29
• 나. H IV-1/M uLV pseudotyped 바이러스 제조용 유전자 제조...29
• 다. H IV-1/M uLV pseudotyped 바이러스의 제조...30
• 라. H IV-1/M uLV pseudotyped 바이러스의 감염성 조사...31
• 마. 펩타이드의 항 H IV 활성 측정...31
• 바. 펩타이드의 2차 구조 분석...32
• 2.α-M SH 의 개량을 통한 비만 억제제 도출에 관한 연구...32
• 가.α-M SH 유래 펩타이드의 합성...32
• 나. 기능성 펩타이드의 활성 측정을 위한 시스템의 확보...32
• 다. 기능성 펩타이드의 설계...33
• 라. 기능성 펩타이드의 구조와 기능간의 상관관계 규명...33
• 마. M C-4R 발현 분석 실험과 이의 기능적 검사...34
• 제 3 절. 연구수행 내용 및 결과...35
• 1. gp41 단백질에서 유래된 항 H IV 펩타이드의 개량 연구...35
• 가. 펩타이드 합성...35
• 나. H IV-1/M uLV pseudotyped 바이러스 제조용 유전자 제조...35
• 다. H IV-1/M uLV pseudotyped 바이러스 제조 및 이를 이용한 숙주세포의 감염성 및 감염 특이성 조사...36
• 라. 세포 융합에 의한 H IV-1 표면단백질과 숙주 수용체의 상호작용 분석 및 펩타이드의 항 H IV-1 활성 측정...37
• 마. 다양한 H IV strain들로 부터 유래된 C34 펩타이드들의 항 H IV-1 활성 분석...38
• 바. C34-89.6의 항 H IV-1 활성 증가에 영향을 주는 부위 탐색...38
• 사. Gp41 N -말단 coiled coil 구조에서 유래된 펩타이드들의 항 H IV-1 활성 분석...40
• 아. C-peptide 들의 N -말단 m odification이 항 H IV-1 활성에 미치는 영향 분석...40
• 자. Constrained force에 의한 항 H IV-1 활성 증진 연구...41
• 차. 펩타이드 구조와 기능간의 상관관계 연구...42
• 2.α-M SH 의 개량을 통한 비만 억제제 도출에 관한 연구...43
• 가. 기능성 펩타이드의 합성 및 관련기술 확보...43
• 나. 기능성 펩타이드의 활성 측정을 위한 시스템의 확보...45
• 다. 멜라노코틴 수용체들에 대한 결합능력 분석...45
• 라. 멜라노코틴 수용체의 신호전달기능 측정...46
• 마. 기능성 펩타이드의 설계...46
• 바. 항-M C-4R 항체의 제조 및 이를 이용한 각 세포들의 M C-4R 발현 분석 실험...52
• 사. M C-4R로 형질 전환된 세포에서의 M C-4R의 발현 및 발현정도 조사...54
• 아. 신경세포유래 M C-4R의 발현 세포주의 확보 와 항체를 이용한 M C-4R 발현의 동정...55
• 제 4 장. 연구개발목표 달성도 및 대외기여도...57
• 제 1 절. 연구개발목표의 달성도...57
• 제 2 절. 대표적 성공사례...59
• 제 3 절. 연구결과의 관련분야의 기술발전에의 기여도...60
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획...61
• 제 6 장 참고문헌...62