초록 ▼

I. 제목 신생아 호흡불량증후군 치료를 위한 성분 재조정 및 인공 폐 계면활성제의 개발 II. 연구개발의 목적 및 필요성 신생아 호흡불량증후군 (Respiratory Distress Syndrome 이하 RDS 라 칭함) 은 미숙신생아 사망원인의 제 1위로 이의 예방과 적절한 관리는 신생아학의 최대 관심사이며 이를 위해 최근 수십 년간 연구가 진행되어 많은 진전이 이루어져 왔다. 1959년 Avery등에 의해 RDS의 병태 생리를 폐 계면활성물질(pulmonary surfactant)의 부족이라고 규명한 이후, 이 물

I. 제목 신생아 호흡불량증후군 치료를 위한 성분 재조정 및 인공 폐 계면활성제의 개발 II. 연구개발의 목적 및 필요성 신생아 호흡불량증후군 (Respiratory Distress Syndrome 이하 RDS 라 칭함) 은 미숙신생아 사망원인의 제 1위로 이의 예방과 적절한 관리는 신생아학의 최대 관심사이며 이를 위해 최근 수십 년간 연구가 진행되어 많은 진전이 이루어져 왔다. 1959년 Avery등에 의해 RDS의 병태 생리를 폐 계면활성물질(pulmonary surfactant)의 부족이라고 규명한 이후, 이 물질의 생리학적, 생화학적, 형태학적, 분자생물학적 성질과 기능이 점차 규명되었다. 1980년 일본의 Fujiwara Testuro 를 효시로 이 질환의 기본적인 병인인 미숙아 RDS에서 부족한 폐 계면활성제를 기도를 통해 인위적으로 보충하여 폐 기능을 호전시키는 인공 폐 계면활성제 보충요법이 시작된 이래 여러 종류의 인공 폐 계면활성제가 개발되어 in vitro 및 in vivo 의 실험과 실제 신생아 환아에서의 임상적 시험을 거쳐, 이 방법을 신생아 RDS의 기본적인 치료 개념으로 정립되어 지난 20여년간 미숙아 사망 방지에 큰 기여를 하였다. 국내의 경우 경제 사회적 여건이 향상됨에 따라 신생아학에 대한 관심이 고조되어 있고 신생아 집중관리 (NICU, Neona Intensive Care Unit)의 중요성과 필요성이 인식되어가고 있다. 실제 인공 폐 계면활성제 보충요법이 최근 2년전 부터 임상적 이용이 가능하게 되었으나 치료에 사용하는 전량이 수입되고 있으며 높은 가격이므로 쉽게 사용하기 어렵다. 따라서 국내에서 RDS의 예방과 치료를 위해 폐 계면활성제의 개발이 시급한 실정이며 국내의 생명공학 기술의 발전 수준이 외국 선진국에 비해 뒤지지 않으므로 폐 계면활성제의 개발에 큰 어려움은 없을 것으로 생각된다. 또한 폐 계면활성제의 대량 생산에 따른 치료비의 대폭 절감으로 천식과 같은 기관지 관련 만성 질환, 만성 폐렴 및 노인성 질환에도 적용이 가능하게 됨으로써 활용분야가 더욱 넓어지게 되고 따라서 새로운 시장의 창출 효과도 있다. III. 연구개발의 내용 및 범위 1. 소의 폐로부터 CNS (Crude Natural Surfactant)의 분리 소의 폐 (5kg) 로부터 37℃ 생리식염수 20l 로 세척하여 폐 계면활성제 를 모으고 (lung lavage) 15,000 Xg 로 1시간동안 4℃ 로 원심분리하여 천연 폐 계면활성제 (CNS)를 획득하였다. CNS로 부터 폐 계면활성제를 얻어내기 위해 유기용매 처리 조건들올 조사하여 in vitro 물리적 특성을 만족시키는 추출 유기 용매를 선택하였다. 2 천연 폐 계면활성제 (CNS) 에 포함된 phospholipid, cholesterol, triacylglycehde 의 정량 및 구성비 분석 소 폐의 세정액 (lavage)로부터 얻은 천연 폐 계면활성제에 포함된 phospholipid, cholesterol, triacylglyceride를 각각 정량하였다. phospholipid는 acid hydrolysis 후 inorganic phosphorus를 정량함으로써, cholesterol은 o-phthaldehyde를 이용하여 정량하였다. Triacylglyceride는 KOH로 비누화시킨 후 acetylacetone올 이용하여 정량하였고 이 결과를 시판되고 있는 S-TAR (Surfacten, Tokyo Tanabe Co.)와 구성비를 비교하였다. 3. 인공 폐 계면활성제의 제조 소의 폐 계면활성제의 hydrophobic protein 인 SP-B 의 C-terminal end 쪽으로부터 truncation된 두 종류의 펩타이드를 합성하였다. 합성 펩타이드와 인지질 (dipalmitoylphosphatidylcholine : phosphatidylglycerol = 3:1)을 1:10 (w/w) 의 비율로 섞고 용매를 날려 보내어 제거하였다. 4 In vitro 물리적 특성 분석 정제한 폐 계면활성제의 in vitro 물리 화학적 특성은 modified Wilhemly plate method 로 수행하였으며 표면확산도 (surface spreading rate), 표면흡착력 (surface adsorption rate) 및 surface tension -area diagram (동적 표면 장력-면적 곡선) 등을 실험하였다. IV. 연구개발 결과 및 활용에 관한 건의 1. 소 폐로부터 폐 계면활성제의 분리와 지질 조성 분석 Bovine lung lavage 에서 얻은 CNS 의 양은 약 22g 이었다. CNS의 phospholipid, cholesterol, triacylglyceride 등의 지질 조성을 분석한 결과, phospholipid는 74%, cholesterol은 11.5%, triacylglyceride는 14% 이었고. 시판되는 ST-A의 경우는 phospholipid는 83.5%, triacylglyceride는 7%, cholesterol 은 거의 검출되지 않을 정도의 적은 양이었다. 2. 천연 폐 계면활성제의 in vitro 물리적 특성의 분석 본 연구팀에서 분리한 천연 폐 계면활성제는 추출 유기용매로 1-butanol 을 사용하거나 chloroform-methanol (3:1) 을 사용하였다. Chloroform-methanol (3:1) 로 추출한 경우는 물리적 특성이 Fujiwara 가 만든 물리적 기준에 적합했으나 1-butanol을 사용한 경우는 그렇지 못했다. 또한 chloroform-methanol (3:1) 로 추출한 경우 현재 제품으로 나와 임상에서 사용하고 있는 S-TA의 물리적 특성과 거의 일치하게 만족하고 있지만 1-butanol 추출물의 경우는 많이 부족하였다. 3. 인공 폐 계면활성제의 in vitro 물리적 특성의 분석 소의 폐 계면활성제 소수성 단백질 중의 하나인 SP-B의 아미노산 서열 로부터 14 또는 17개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 합성하여 인지질과 재조합시걱 in vitro 물리적 특성을 조사하여 보았더니 CNS 보다는 활성이 조금 낮았지만 유의할 수준의 활성을 갖고있었다 V. 연구 수행 결과의 활용 계획 한 마리 소 폐로부터 얻은 천연 폐 계면활성제 (CNS)는 22g이었으며, 추출 유기 용매는 1-butanol을 사용하거나 (CNS-BuOH), chloroform-methanol (3:1) (CNS-CM)을 사용하였다. CNS-CM 의 경우가 in vitro 물리적 특성이 더 좋았으며, 지질들의 조성비가 시판되는 S-TA와 상당히 달랐다. 무엇보다도 cholesterol의 조성비가 달랐는데 이렇게 성분이 다른 이유는 S-TA를 제조한 방법이 본 연구팀의 경우와 차이가 나기 때문인 것 같다. 따라서 성분 재조합 폐 계면활성제의 조성 규격을 설정할 때 고려해야할 것이다. 인공 폐 계면활성제를 구성하는 합성 펩타이드 2종류와 인지질의 조성 을 확립하였다. 인공 폐 계면활성제가 천연에 비해 낮은 활성을 갖고 있으나 유의할 수준이었고, 앞으로 인지질과 펩타이드이외의 지방산 및 콜레스테롤의 첨가로 더 나은 활성을 갖을 것으로 기대한다.

목차 Contents

• 제 1 장 서 론...9
• 제 2 장 국내외 기술 개발 현황...12
• 제 3 장 연구 수행 내용 및 결과...16
• 제 1 절 연구수행내용...16
• 1. Bovine Lung Crude Natural Surfactant 의 분리...16
• 2. Phospholipid, cholesterol, triacylglycerol의 정량...16
• 3. 인공 폐 계면활정제의 제조...21
• 4. In vitro 물리적 특성 측정...21
• 1)표면확산도 (surface spreading rate)의 측정...22
• 2)표면흡착도 (Surface adsorption rate)의 측정...22
• 3)동적 표면장력-면적곡선(Surface tension-area diagram)...23
• 제 2 절 연구결과...23
• 1. 소폐로부터 천연 폐 계면활성제의 분리...23
• 2. In vitro 물리적 특성 규명...25
• 1)표면확산도 (surface spreading rate)의 측정...25
• 2)표면흡착도 (surface adsorption rate)의 측정...25
• 3) 동적 표면장력-면적곡선(Surface tension-area diagram)...25
• 3. 인공 폐 계면활성제의 in vitro 물리적 특성 분석...26
• 4. 천연 폐 계면활성제의 지질 조성 분석...26
• 제 4 장 연구 개발 목표 달성도와 대외 기여도...33
• 제 5 장 연구 개발 결과의 활용 계획...35
• 제 6 장 참고문헌...37