초록 ▼

Ⅰ. 제 목 수산단백질자원으로부터 항고혈압 기능성 peptide개발에 관한 연구 Ⅱ. 연구개발의 목적 및 필요성 식품은 생체유지에 필요한 영양물질을 공급하는 영양적 기능과 식품의 색, 풍미 등 식사의 즐거움을 주는 감각기능과 미량성분으로서 생체의 재계통을 조절하는 생체조절기능을 가지고 있는데, 최근에는 생체조절기능에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 식품중에 미량으로 존재하고 있는 성분으로서 생체조절에 관여하는 물질은 대부분이 단백질이나 호르몬류이며, 이들 성분이 성분이 면역계, 신경계 및 내분비계 등에 관여하는 조절

Ⅰ. 제 목 수산단백질자원으로부터 항고혈압 기능성 peptide개발에 관한 연구 Ⅱ. 연구개발의 목적 및 필요성 식품은 생체유지에 필요한 영양물질을 공급하는 영양적 기능과 식품의 색, 풍미 등 식사의 즐거움을 주는 감각기능과 미량성분으로서 생체의 재계통을 조절하는 생체조절기능을 가지고 있는데, 최근에는 생체조절기능에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 식품중에 미량으로 존재하고 있는 성분으로서 생체조절에 관여하는 물질은 대부분이 단백질이나 호르몬류이며, 이들 성분이 성분이 면역계, 신경계 및 내분비계 등에 관여하는 조절기구를 생화학적으로 해명하기 위하여 생리활성물질의 검색, 구조의 결정, 체내의 흡수, 기능발현 및 식품성분 상호간의 영향 등에 관한 연구가 수행되고 있다. 한편, 단백질은 각종 효소에 의하여 가수분해되면 여러 가지 생리활성을 나타내는 peptide를 생성하는 것으로 알려져 있는데, 특히 peptide의 항고혈압 효과에 관한 연구가 많다. 고혈압은 현대의 성인병 가운데서도 심각한 사회문제로 대두되고 있는 질병의 하나로서 고혈압증을 치료하기 위한 여러가지 혈압강하제들이 합성되어 시판되고 있으나 일시적인 증상요법에 치우치고 있으며, 더우기 여러가지 부작용을 수반하므로 보다 안전한 치료제의 개발이 요구된다. 고혈압증의 90% 이상을 차지하고 있는 본태성 고혈압증(essential hypertension)은 정상적인 혈압을 유지하는 조절기구들이 천천히 붕괴되어 진행되는 질병이다. 이러한 본태성 고혈압의 원인 중에서 renin, angiotensin계가 혈압조절에 매우 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 즉, angiotensinogen이 renin의 분해를 받아서 angiotensin Ⅰ을 생성하는데, 이는 angiotensin전환효소(angiotensin converting enzyme, ACE ; peptidyldipeptide hydrolase, EC 3.4.15.1)에 의하여 C 말단의 depeptide가 절단되어 강력한 혈관수축작용을 하는 angiotensin Ⅱ를 생성한다. 또한 ACE는 혈관이완 작용을 가진 bradykinin을 분해하여 불활성화 시킴으로써 결과적으로 혈압을 상승시키는 역할을 한다. 이와같이 혈압의 상승에는 ACE가 크게 관여함으로 혈압의 강하에는 ACE의 저해가 필수적이라 하겠다. 이와 관련하여 1970년대초 ACE저해작용을 갖는 peptide인 tetrotide가 브라질과 일본산 독사의 독액으로부터 분리되었다. tetrotide는 고(高)renin증 고혈압 환자에서 뿐만아니라 정상인에서도 현저한 혈압강화작용을 갖는 것으로 밝혀짐으로써 ACE저해제들의 고혈압 치료제로서의 개발 가능성이 제시되었으며, 1988년 미국 고혈압 합동위원회에서는 ACE저해제를 고혈압 치료제로서 공인하게 되므로써 고혈압 예방 및 치료에 있어서 ACE저해제의 중요성이 부각되게 되었다. ACE는 활성발현에 Zn+2과 Cl-을 필요로 하는 metallopeptidase로서 다른 zinc metallopeptidase들, 특히 carboxypeptidase A와의 유사점 등을 감안하여 Ondetti et al.(1977)이 비 peptide형 ACE 저해제들의 합성을 시도하였다. 이들은 mercaptoacylamino acid계가 강력한 억제작용을 나타내는 것으로 알려져 있으며, 특히 captopril은 임상에 적용되고 있으며, 그 결과 종래의 혈압강하제로는 치료되지 않던 심한 고혈압증에도 좋은 효과를 보이고 있으며, 중추신경 또는 교감신경계에 작용하는 종래의 혈압강하제에서 문제되는 여러 가지 부작용이 발견되지 않았다. 그러나, 단백뇨증(proteinuria) 또는 무과립구증(agranulocytosis) 등의 부작용이 문제점으로 대두되었으며, 이들 부작용들은 captopril의 sulfhydryl기에 기인하는 것으로 추정되어, sulfhydryl기를 갖지 않는 enalapril의 합성을 시도하였다. 또한 이미 생성된 angiotensin Ⅱ의 작용을 억제하는 angiotensin Ⅱ 수용체의 길항제로는 benzylimidazole acetic acid를 기본 골격으로 하는 CV-2198 (1-benzyl-4-chloro-2-phenyl-imidazole-5-acetic acid)이 합성되어 고혈압 자연발생증 쥐(spontaneously hypertensive rats)에 대한 혈압강하작용이 검토되었다. 한편, 식품성분 중에서 ACE저해효과를 나타내는 성분으로는 여러 가지 식품단백질의 효소 가수분해물로부터 얻어진 peptide류를 중심으로 주로 연구되고 있다. 즉, casein, zein, gelatin, 무화과 유액, 쌀, 대두, 청주와 그 부산물인 술 지게미, 정어리육, 가다랑어육과 내장 등의 가수분해물로부터 ACE 저해 peptide를 분리하여 아미노산 배열을 해석하고, 이를 기초로 peptide를 화학적으로 합성하여 저해효과에 미치는 C 및 N말단 아미노산의 영향에 대하여 검토하였다. Kohmura et al.(1989, 1990a, 1990b)은 모유 casein유래의 peptide와 아미노산 배열이 같은 peptide를 합성하여 이들의 ACE저해효과를 조사함으로서 이들 ACE저해효과를 가진 peptide가 모유 단백질인 casein의 아미노산 배열상에 존재한다는 것을 밝히고, 식품단백질이 생체내에서 효소적으로 가수분해될 때에 이들 ACE저해효과를 가진 peptide가 생성될 수 있다는 것을 시사하였다. 식품성분으로부터 얻어진 비 peptide형의 ACE저해인자로는 간장에서 분리한 수용성 성분인 nicotianamine과 쌀겨로부터 분리한 phytic acid등이 보고되고 있다. 그리고, 차(茶)성분에 의한 ACE저해효과는 차의 polyphenol성분에 의하며, 한국산 녹차에서 탄닌을 분리하여 ACE저해효과를 측정한 결과, 정제된 탄닌의 ACE저해효과는 gallate가 결합된 galloyl tannin류가 nongalloyl tannin류보다 저해효과가 우수한 것으로 확인 되었다. 이와같이 식품단백질 가수분해물이 갖는 생리활성 작용에 관한 연구는 최근에 큰 관심의 대상이 되고 있다. 그러나, 우리나라의 경우에는 영양원으로서 수산물 단백질에 의한 의존도가 높음에도 불구하고 이들의 생리활성 특히, 고혈압의 억제와 관련이 있는 혈압강하 작용을 나타내는 기능성 소재의 연구는 미약한 실정이고, 또한 이에 관한 체계적인 탐색, 분리방법 및 그 이용에 관한 기반 기술은 매우 부족한 상황이다. 따라서, 본 연구에서는 수산단백질자원의 이화학적 특성 및 전처리 조건 검토 후, 수산단백질을 분리하여 peptide를 제조, 정제함으로서 기능성 peptide 소재를 개발하고자 하였다. Ⅲ. 연구개발의 내용 및 방법 1. 시료의 전처리 및 수산단백질의 분리 선도가 양호한 시료로 부터 어육을 취하여 세절 분쇄하고, 탈지하기 위한 용매처리후 흡입 여과하여 진공동결 건조하여 어육단백질을 제조 함. 2. 단백질 가수분해물의 제조 어육단백질에 일정량의 증류수를 가하여, 효소의 최적 분해 조건에서 가분해 후, 280nm에서의 흡광도, Brix, HPLC에 의한 분자량을 조사하여 어육의 최적 가수분해조건을 설정한다. 3. 가수분해물의 분획 단백질 가수분해물은 membrane으로 여과하여 어육 가수분해물의 분자량 분포도를 조사한다. 4. 아미노산 분석 HPLC를 이용하여 구성 아미노산 분석 함. 5. Angiotensin 1 전환 효소(ACE) 沮害作用 ACE저해작용은 Cushman과 Cheung(1971)의 방법으로 측정 함. 6. in vivo에서의 항고혈압 효과 측정 어육을 가수분해하여 제조한 peptide를 자연발생고혈압쥐에 투여하여 혈압강하효과를 조사 함 Ⅳ. 연구개발 결과 1. 수산단백질자원의 이화학적 특성 어육 Peptide를 제조하기 위한 원료로 국내에서 생산량이 많은 고등어, 멸치 그리고 명태를 선정하였으며, 이들의 일반성분을 조사하였다. 고등어는 적색육 어류로 지질함량이 매우높은 것으로 나타나 건물로 보면 32.6%였고 단백질은 63.3%였다. 멸치는 건물로 보면 지질 함량이 16.3%, 단백질 함량은 70.2%로 나타함량은 88.8%로 가장 높았다. 2. 원료의 전처리 조건 검토 명태와 고등어는 선도가 양호한 시료를 구입하여 두부, 내장 및 뼈 등을 제거한 뒤 어육을 취하여 세절 분쇄하고, 탈지하기 위하여 5배량의 용매(chloroform : MeOH = 3 : 2, v/v) 처리후 흡입 여과하고 40℃에서 열풍 건조하였다. 건조한 탈지분말 시료의 수율을 조사하기 위하여 무게를 측정하고 분쇄한 후 40mesh체로 처서 탈지분말을 제조하였으며, 멸치는 신선한 시료 구입하여 수세한 후 전어체를 세절 분쇄하고 앞에서와 같은 방법으로 처리하여 탈지분말을 제조 하였다. 고등어와 명태의 경우 두부, 내장 및 뼈 등을 제거한 어육의 수율은 고등어 65.52%, 명태는 43.5%였으며, 멸치는 전어체를 이용하였다. 탈지어육분말의 수율은 고등어 18.2%, 멸치는 15.0% 그리고 명태는 15.7%로 나타났다. 3. 어육 가수분해 조건 설정 멸치육 및 냉동 명태육 단백질에 대하여 분해효과가 가장 좋은 효소는 Protamax였고, 다음으로 Papain 30,000이었고, 고등어육 및 생태육 단백질에 대하여 분해효과가 가장 좋은 효소는 Papain 30,000이었으며, 다음으로 Protamax인 것으로 나타났다. 효소의 처리농도는 어육에 대하여 1%가 적절한 것으로 판단되었다. 효소 가수분해는 endo형의 효소로 1차 가수분해하고 exo형의 효소로 2차 가수분해 하였다. 1차 가수분해 시간은 4시간, 2차 가수분해 시간은 2시간이 적절하였다. 고등어육을 효과적으로 가수분해 할 수 있는 효소 및 농도를 선정하기 위하여 가수분해물의 흡광도와 Brix를 조사하였다. 효소의 농도를 0, 0.3, 0.6, 0.9, 1.2% 범위에서 가수분해 했을 때, 효소의 처리 농도가 높을수록 280nm 에서의 흡광도와 Brix가 증가되는 것으로 나타났으며, 특히 Papain 30,000 이 가장 효과가 좋았으며 그 다음으로 Promod 효소의 효과가 좋은 것으로 나타났고 효소의 처리 농도는 1%가 적절 한 것으로 판단되었다. 멸치육을 효과적으로 가수분해 할 수 있는 효소 및 농도를 선정하기 위하여 가수분해물의 흡광도를 조사하였다. 효소의 농도를 0, 0.3, 0.6, 0.9, 1.2% 범위에서 가수분해 했을 때, 효소의 처리 농도가 높을 수록 280nm 에서의 흡광도와 Brix가 증가되는 것으로 나타났으며, 특히 Promod 가 가장 효과가 좋았으며, 그 다음으로 Papain 30,000 효소의 효과가 좋은 것으로 나타났고 효소의 처리 농도는 1%가 적절 한 것으로 나타났다. 명태육을 효과적으로 가수분해 할 수 있는 효소 및 농도를 선정하기 위하여 가수분해물의 흡광도 및 Brix를 조사하였다. 효소의 농도를 0, 0.3, 0.6, 0.9, 1.2% 범위에서 가수분해 했을 때, 효소의 처리 농도가 높을 수록 280nm 에서의 흡광도와 Brix가 증가되는 것으로 나타났으며, 특히 Papain 30,000 이 가장 효과가 좋았으며, 그 다음으로 Protamax, Colluplin 효소의 효과가 좋은 것으로 나타났고 효소의 처리 농도는 1%가 적절 한 것으로 나타났다. 냉동 명태육은 선어 명태에 비하여 가격이 저렴하므로 peptide제조용 원료로 이용 가능성을 살펴 보기 위하여 동일한 방법으로 가수분해물의 흡광도를 조사하였다. 효소의 농도를 0, 0.3, 0.6, 0.9, 1.2% 범위에서 가수분해 했을 때, 효소의 처리 농도가 높을 수록 280nm 에서의 흡광도와 Brix가 증가되는 것으로 나타났으며, 특히 Protamax 가 가장 효과가 좋았으며, 그 다음으로 Papain 30,000 효소의 효과가 좋은 것으로 나타났고, 효소의 처리 농도는 1%가 적절 한 것으로 나타났다. 가수분해 효과가 좋게 나타난 Promod 192P, Protamax 그리고 Papain 30,000을 사용하여 최적의 가수분해 시간을 알아보기 위하여 멸치육, 명태육 그리고, 고등어육에 대하여 1%의 효소를 첨가하고 1, 2, 3, 4, 5, 6시간 가수분해한 가수분해물의 280nm에서의 흡광도와 Brix를 조사한 결과, 가수분해 시간이 경과함에 따라 흡광도와 Brix가 증가하는 것으로 나타났다. 즉, 4시간 가수분해한 경우 1시간 가수분해한 가수분해물에 비해 흡광도는 2～3배 증가하였고, Brix는 1.2～1.3배 증가하였다. 4. 어육 Peptide제조 어육 Peptide제조하기 위한 주요 공정은 다음과 같다. 즉, 신선한 원료를 구입하여 두부와 내장 그리고 뼈를 제거하고 혈액 및 염분등의 이물질을 제거하기 위하여 수세한다. 지질 함량이 많은 어류는 탈지한다. 수세한 원료를 마쇄하고 2배량의 물을 첨가하고 효소를 사용하여 가수분해하고 여과하여 Peptide원액을 제조한다. Peptide원액을 적당한 농도로 감압농축하고 진공동결 건조하여 어류 Peptide분말을 제조하였다. 원료로 사용하는 어류에 따라 peptide제조 과정에 차이가 있었다. 고등어 peptide의 제조 경우, 7.6Kg 고등어에서 두부, 내장 및 뼈를 제거하여 5Kg의 고등어 육을 얻었다. 혈액 및 이물질을 제거하기 위하여 수세하였으며, 수세한 고등어육중에는 지질이 많이 함유되어 있으므로 지질을 제거하기 위하여 0.05%의 NaCl이 함유된 0.1% NaHCO3 용액 4배량을 첨가하고 콜로이드밀로 마쇄하고 원심분리하여 지질을 제거하였다. 탈지한 어육에 2배량의 물을 첨가하고 단백질 가수분해 효소를 사용하여 가수분해 하였다. 가수분해는 1차로 endo형의 Papain 30,000으로 4시간 가수분해한 후 exo형의 Promod 192P효소로 2시간 2차 가수분해를 행하였다. 그리고, 효소를 불활성화 시키기 위하여 5분간 끓인 다음 규조토를 사용하여 여과하였다. 여과액의 Brix는 4.8이었다. 여과액의 부피를 줄이기 위하여 감압 농축기로 농축하고 진공동결건조하여 고등어 peptide 분말을 제조하였다. 동결건조한 고등어 peptide분말은 570g이었다. 멸치 peptide의 제조 경우에는 전어체를 사용하였다. 혈액 및 이물질을 제거하기 위하여 수세하였으며, 수세한 멸치중에는 지질이 많이 함유되어 있으므로 지질을 제거하기 위하여 고등어육과 동일한 방법으로 0.05%의 NaCl이 함유된 0.1% NaHCO3 용액 4배량을 첨가하고 콜로이드밀로 마쇄하고 원심분리하여 지질을 제거하였다. 탈지한 어육에 2배량의 물을 첨가하고 단백질 가수분해 효소를 사용하여 가수분해 하였다. 가수분해는 1차로 endo형의 Papain 30,000으로 4시간 가수분해한 후 exo형의 Promod 192P효소로 2시간 2차 가수분해를 행하였다. 그리고, 효소를 불활성화 시키기 위하여 5분간 끓인 다음 규조토를 사용하여 여과하였다. 여과액의 부피를 줄이기 위하여 감압 농축기로 농축하고 진공동결건조하여 멸치 peptide 분말을 제조하였다. 명태 peptide의 제조 경우, 고등어에서 두부, 내장 및 뼈를 제거하여 명태육을 취하였다. 혈액 및 이물질을 제거하기 위하여 수세하였으며, 수세한 명태육은 Silent Cutter로 마쇄 하였다. 마쇄한 명태육에 2배량의 물을 첨가하고 단백질 가수분해 효소를 사용하여 가수분해 하였다. 가수분해는 1차로 endo형의 Papain 30,000으로 4시간 가수분해한 후 exo형의 Promod 192P효소로 2시간 2차 가수분해를 행하였다. 그리고, 효소를 불활성화 시키기 위하여 5분간 끓인 다음 규조토를 사용하여 여과하였다. 여과액의 부피를 줄이기 위하여 감압 농축기로 농축하고 진공동결건조하여 명태 peptide 분말을 제조하였다. 단백질 가수분해 효소를 사용하여 가수분해한 어육 가수분해물의 분자량을 조사하였다. 멸치육을 1차로 Papain 30,000으로 4시간 가수분해하고 Promod 192P로 2차 가수분해한 경우, 4시간 동안 1차 가수분해 했을 때 분자량 500이하가 11%였고, 1000～2000의 분자량이 59.1% 10만 이상이 29.9%로 나타났다. Promod 192P로 2시간더 가수분해하니 500이하의 분자량이 11%, 500～1000의 분자량이 54.6% 1000～2000의 분자량??로 2시간이 적절한 것으로 판단되었다. 고등어육을 1차로 Papain 30,000으로 4시간 가수분해하고 Promod 192P로 2차 가수분해한 경우, 4시간 동안 1차 가수분해 했을 때, 분자량 500이하가 11.6%였고, 1000～2000의 분자량이 88.4%로 나타났다. Promod 192P로 2시간더 가수분해하니 500이하의 분자량이 63.7%, 1000～2000의 분자량이 36.3%로 나타나 가수분해 조건은 1차로 4시간 2차로 2시간이 적절한 것으로 판단되었다. 명태육을 1차로 Papain 30,000으로 4시간 가수분해하고 Promod 192P로 2차 가수분해한 경우, 4시간 동안 1차 가수분해 했을 때 분자량 500이하가 33.1%였고, 500～1000의 분자량이 24.4% 1000～2000의 분자량이 29.9% 그리고 1만 이상이 12.6%로 나타났다. Promod 192P로 2시간더 가수분해하니 500이하의 분자량이 95.9%, 1만 이상이 4.1%로 나타났고 가수분해시간을 길게 했을 때도 분자량의 분포도는 비슷하였다. 5. Peptide 분리 및 정제 명태 가수분해물을 membrane으로 분획한 결과, 500이하가 80.14%, 500～3,000이 0.45%, 3,000～10,000이 0.49% 그리고 1만 이상이 18.92%로 나타나 대부분이 분자량 500이하로 나타났다. 멸치 가수분해물을 membrane으로 분획한 결과, 500이하가 94.57%, 500～3,000이 0.46%, 3,000～10,000이 1.95% 그리고 1만 이상이 3.02%로 나타나 대부분이 분자량 500이하로 나타났다. 고등어 가수분해물을 membrane으로 분획한 결과, 500이하가 78.11%, 500～3,000이 0.57%, 3,000～10,000이 0.90% 그리고 1만 이상이 20.42%로 나타나 대부분이 분자량 500이하로 나타났다. 고등어 가수분해물의 색소를 제거하기 위하여 활성탄을 처리하였다. 활성탄의 첨가 농도를 1, 3, 5, 7%로 한 결과,처리농도를 높일수록 탈색 효과가 증가하였으며, 1, 3, 5 그리고 7%처리시 탈색율은 19.5 44.2 66.2 그리고 70.3로 나타났다. 활성탄의 처리 농도를 5%로 하고 활성탄 처리 시간을 20, 40, 60, 80 그리고 100분간 처리한 결과, 탈색율은 66.2 73.0 75.7 75.7 그리고 75.7%로 나타났다. 위의 결과로부터 활성탄 처리 조건은 5%농도로 1시간이 적절할 것으로 생각되었다. 6. 아미노산 조성 본 실험에 사용한 고등어 명태 그리고 멸치로 제조한 어육단백질의 아미노산 조성을 분석한 결과, 고등어 단백질의 경우에는 glutamic acid의 함량이 7.5%로 가장 높은 것으로 나타났고, 그 다음으로 aspartic acid, Lysine 그리고 leucine이 각각 5.1 4.6 그리고 4.4로 나타났다. 명태에서도 고등어와 마찬가지로 glutamic acid의 함량이 10.4%로 가장 높은 것으로 나타났고, 그 다음으로 aspartic acid, Lysine 그리고 leucine이 7.4 6.7 그리고 5.2로 나타났다. 멸치에서는 glutamic acid의 함량이 11.1%로 가장 높은 것으로 나타났고, 그 다음으로 aspartic acid, Lysine 그리고 leucine이 8.0 7.4 그리고 5.9로 나타났다. 어육 peptide의 아미노산 조성을 분석한 결과, 고등어 peptide의 경우에는 glutamic acid의 함량이 12.6%로 가장 높은 것으로 나타났고, 그 다음으로 leucine, aspartic acid 그리고 Lysine이 각각 6.9, 6.6 그리고 6.0으로 나타났다. 명태에서는 glutamic acid의 함량이 11.7%로 가장 높은 것으로 나타났고, 그 다음으로 aspartic acid, Lysine 그리고 leucine이 7.3, 7.2 그리고 6.5로 나타났다. 멸치에서는 glutamic acid의 함량이 12.0%로 가장 높은 것으로 나타났고, 그 다음으로 Lysine, aspartic acid 그리고 leucine이 8.3, 8.0 그리고 7.0으로 나타났다.위의 결과로부터 어육단백질과 peptide에는 glutamic acid, aspartic acid, lysine 그리고 leucine이 가장 많이 함유되어 있었다. 7. 항고혈압 효과 어육가수분해물을 50, 250 그리고 500㎍ 첨가했을 때 첨가량이 증가됨에 따라서 ACE저해 효과가 증가하였다. 500㎍을 첨가했을 때 멸치, 명태 그리고 고등어의 ACE저해 효과는 각각 75, 81 그리고 35%로 나타나 명태 가수분해물의 ACE저해 효과가 가장 좋은 것으로 나타났다. 어육 가수분해물을 membrane을 이용하여 분자량별로 분획하여 분자량에 따른 ACE저해 효과를 측정 결과, 1만 이상의 획분에서는 ACE저해 효과가 낮게 나타났고 1만 이하의 저분자 획분은 효과가 강한 것으로 나타났다. 어육 peptide를 증류수에 희석하여 본태성고혈압쥐(SHR)에 음용수로 공급하면서 경시적인 수축기 혈압의 변화를 조사한 결과, 실험 개시시의 기준혈압은 처리군간 차이가 없이 평균 223.7mmHg이었으나, 명태와 고등어 peptide를 음용시킨 3일째에 10mmHg 이상 수축기 혈압이 감소하는 경향을 나타내었으며, 특히 고등어 peptide를 음용시킨 처리구에서는 28일째 수축기 혈압이 기준시점의 혈압대비 30mmHg이상 감소한 것으로 나타났다. 8. 고등어 펩타이드의 분리정제 고등어 유래의 peptide를 제조하고, Sephadex G-25 column, ODS AQ column, Vydac column, Superdex peptide column을 이용하여 순차적으로 분리, 정제하였으며 그 결과를 요약하면 다음과 같다. 고등어 선어로부터 두부, 내장 및 뼈를 제거하여 얻은 고등어 육의 수율은 65.5%였으며, 고등어육의 단백질 함량은 63.3%, 그리고 지질함량은 32.6%로 나타났다. 지질을 제거하기 위하여 알칼리 처리한 후 동결 건조한 고등어 단백질의 수율은 고등어 육에 대하여 18.2%로 나타났고, 고등어 단백질을 효소가수분해하여 제조한 고등어 가수분해물의 수율은 50.6%로 나타났다. 고등어 가수분해물 cut-off 1만의 membrane으로 ultrafiltration한 결과, MW 10,000이하가 79.6%, 10,000 이상이 20.4%였으며, ACE저해효과는 10,000이하 획분이 10,000이상 획분보다 좋은 것으로 나타났다(표 1). 1만 이하 의 획분을 Sephadex G-25 column으로 분획하여, 7개의 획분을 얻었고(그림 1), 이 가운데 MS2획분의 ACE저해효과가 가장 좋았다(표 2). ACE 저해효과가 가장 좋은 MS2획분을 ODS AQ column으로 분획하여 4개의 획분으로 분획 하였고(그림 2), 이 가운데 MS2O3획분의 ACE저해효과가 가장 좋았다(표 3). MS2O3획분을 Vydac column으로 재분획하여 8개의 획분으로 분취하였다(그림 3). 이 가운데 MS2O3V5획분의 ACE저해효과가 가장 좋았다(표 4). Superdex peptide column으로 재정제하여 얻은 peptide의 N-말단으로부터 아미노산 배열은 Tyr-Val-Ala으로 ACE저해활성은 IC50이 1.4μM로 나타났다. Matsumura 등(1993)은 가다랭이 가수분해물로부터 분리한 6개의 peptides 가운데 tripeptide의 ACE저해활성이 높았다고 하였으며, 본 연구 결과에서도 유사한 경향을 나타내었다. 9. 명태 펩타이드의 분리정제 명태 유래의 peptide를 제조하고, Sephadex G-25 column, ODS AQ column, Vydac column, Superdex peptide column을 이용하여 순차적으로 분리, 정제하였으며 그 결과를 요약하면 다음과 같다. 명태 선어로부터 두부, 내장 및 뼈를 제거하여 얻은 명태 육의 수율은 43.5%였으며, 명태 육의 단백질 함량은 88.8%로 나타났다. 지질을 제거하기 위하여 알칼리 처리한 후 동결 건조한 명태 단백질의 수율은 명태 육에??분해하여 제조한 명태 가수분해물의 수율은 88.2%로 나타났다. 명태 가수분해물 cut-off 1만의 membrane으로 ultrafiltration한 결과, MW 10,000이하가 81.1%, 10,000 이상이 18.9%였으며, ACE저해효과는 10,000이하 획분이 10,000이상 획분보다 좋은 것으로 나타났다. 1만 이하 의 획분을 Sephadex G-25 column으로 분획하여, 5개의 획분을 얻었고, 이 가운데 PS2획분의 ACE저해효과가 가장 좋았다. ACE 저해효과가 가장 좋은 PS2획분을 ODS AQ column으로 분획하여 6개의 획분으로 분획 하였고, 이 가운데 PS2O3획분의 ACE저해효과가 가장 좋았다. PS2O3획분을 Vydac column으로 재분획하여 7개의 획분으로 분취하였다. 이 가운데 PS2O3V6획분의 ACE저해효과가 가장 좋았다. PS2O3V6획분을 재분획하여 4개의 획분을 얻고 ACE저해활성이 가장 좋은 PS2O3V6V3를 Superdex peptide column으로 재정제하여 얻은 peptide의 N-말단으로부터 아미노산 배열은 Ala-Leu-Leu으로 ACE저해활성은 IC50이 0.8μM로 나타났다. Ⅴ. 연구개발결과의 활용방안 본 연구 결과를 요약하면 다음과 같다. 먼저 원료로 사용한 어류의 이화학적 특성 및 전처리 조건을 검토하였다. 그리고, 산업적으로 이용 가능한 여러 가지 가수분해 효소를 이용하여 어육의 가수분해 최적 조건을 설정하였다. 효소 가수분해에 의하여 어류 유래의 peptide를 제조하고 항고혈압 기능성을 in vitro와 in vivo에서 확인 하였다. 본 결과를 활용하여 2차년도에서는 항고혈압 기능성 peptide를 제조하고, 이취를 비롯한 문제점을 해결하여, 품질을 개선함으로서 어육 유래 peptide소재를 건강 기능성 소재로 이용 가능한 수준까지 개발 하고자 한다. 그리고 개발된 연구결과를 관련 업체에 기술전수 하여 산업화를 추진하고 있으며, 항고혈압 peptide분리 정제 등 학술적으로 가치가 있는 연구 결과는 전문 학술지에 발표하였다. 그리고, 산업상 이용가능성이 있고, 기술적으로 진보성이 있는 연구결과를 “어육을 이용한 기능성 펩티드 제조방법”이라는 제목으로 특허 출원 하였음.

Abstract ▼

Ⅰ. Title Study on development of antihypertensive peptide using marine proteins Ⅱ. Objective and significance The objectives of this research were to develop antihypertensive peptide from fishs. in resent years, many experiments have been carried out to study biofunctional roles of food in m

Ⅰ. Title Study on development of antihypertensive peptide using marine proteins Ⅱ. Objective and significance The objectives of this research were to develop antihypertensive peptide from fishs. in resent years, many experiments have been carried out to study biofunctional roles of food in maintaining and protecting human health from various disease. through such efforts, peptides produced from protein hydrolyzation were known to have bio-functional properties. functional foods which have properties of foods as well as drugs are very effective on curing and preventing disease. not like drugs, those functional foods usually do not have any side effects. therefore, functional foods will be utilized for curing and preventive foods for disease in the future. enzymatic hydrolysis of fish proteins have biologically active peptides such as opioid peptides, immunostimulating peptides and angiotensin converting enzyme(ACE) inhibitors. resently, the physiological significance of such peptides have been suggested by several research group. ACE(peptidyldipeptide hydrolase) is an exopeptidase that cleaves dipeptides from the C-terminus of various oligopeptides. ACE has an important physiological function in blood pressure regulation, in which ACE converts the inactive decapeptide, angiotensinⅠ, to the potent vasopressor octapeptide, angiotensinⅡ. Ⅲ. Scope and Contents 1. Pretreatment of fishs Fish were separated from bones, intestines and skin. and it was washing to get rid of a freign substance. it was treated with organic solvent or alkali solution to get rid of lipid from fish. 2. Manufacture of fish protein hydrolysate Selecting proteases which show strong and specific hydrolyzing abilities against fish protein. 3. Fractionation of hydrolysate Fractationation of peptides from fish hydrolysates by membrane 4. Amino acid analysis Amino acid analysis of fish proteins and fish peptides by HPLC 5. Assay for ACE inhibitory activity Assay of angiotensin converting enzyme(ACE) inhibitory activities of fish peptides 6. Effects on decrease of blood pressure in SHR Effects on decrease in the systolic blood preasure of SHR after oral feeding of fish peptide. Ⅳ. Conculusion and Recommendation 1. Phycochemical properties of fishs Fishs using in this study were mackerel, anchovy and alaska pollack. lipid contents of mackerel, anchovy and alaska pollack are 32.6 16.3 and 3.6% in dry base. protein contents of mackerel, anchovy and alaska pollack are 63.3 70.2 and 88.8% in dry base. ash contents of mackerel, anchovy and alaska pollack are 4.1 12.7 and 7.6% in dry base. 2. Pretreatment conditions of fishs Contents of fish protein defatted from mackerel, anchovy and alaska pollack are 18.2 15.0 and 15.7% in dry base. contents of edible parts of mackerel, anchovy and alaska pollack are 65.52 43.5 and 100% in wet base. 3. Hydrolysis conditions of fish proteins Fish proteins were hydrolyzed with protease(maxazyme NNP, promod 192P, collupulin, alcalase, flavourzyme, protamax and papain 30,000) at optimum temperature of enzyme. papain 30,000 showed the highest hydrolyzing abilities in fish proteins. it was proper condition to hydrolyze with papain 30,000 for 4hrs first and with promod 192p for 2hrs second. 4. Manufacture of fish peptides Mackerel, anchovy and alaska pollack were hydrolyzed with papain and promod. those are filtered by vaccum pump and concentrated by evaperator and lyophilized. 5. Fractionation of fish peptides When mackerel hydrolysate was fractionated with membrane, molecular weight of hydrolysate was 500 below(78.11%), 500～3,000(0.46%), 3,000～10,000(1.95%) and 10,000 above(3.02%). when alaska pollack hydrolysate was fractionated with membrane, molecular weight of hydrolysate was 500 below(80.14%), 500～3,000(0.45%), 3,000～10,000(0.49%) and 10,000 above(18.92%). when anchovy hydrolysate was fractionated with membrane, molecular weight of hydrolysate was 500 below(94.57%), 500～3,000(0.46%), 3,000～10,000(1.95%) and 10,000 above(3.02%). 6. Amino acid compositions Mackerel protein was mainly composed of glutamic acid(14.3 g/100g), aspartic acid(9.7), lysine(8.8), leucine(8.4) and arginine(6.9). anchovy protein was mainly composed of glutamic acid(14.9 g/100g), aspartic acid(10.7), lysine(9.9), leucine(7.9) and arginine(6.8). alaska pollack protein was mainly composed of glutamic acid(16.2 g/100g), aspartic acid(11.5), lysine(10.4), leucine(8.1) and arginine(6.2). mackerel peptide was mainly composed of glutamic acid(16.6 g/100g), aspartic acid(8.7), lysine(7.9), leucine(9.1) and arginine(6.1). anchovy peptide was mainly composed of glutamic acid(15.0 g/100g), aspartic acid(10.0), lysine(10.3), leucine(8.7) and arginine(6.1). alaska pollack peptide was mainly composed of glutamic acid(15.7 g/100g), aspartic acid(9.8), lysine(9.7), leucine(8.7) and arginine(6.4). 7. Antihypertensive effects The ACE inhibitory activity increased with an increment of amount added. from these results, it is possible to prepare antihypertensive peptide from fishs. Hydrolysate which inhibit the Angiotensin Ⅰ-converting enzyme(ACE) was prepared from mackerel muscle by protease. The ACE inhibitory activity of mackerel muscle hydrolysate(MMH) was 967㎍ of IC50. ACE inhibitory peptides were isolated by ultrafiltration, gel permeation column chromatography(GPC), reversed phase column chromatography(RPC), reversed phase-high performance liquid chromatography(RP-HPLC), and gel permeation high performance liquid chromatography(GP-HPLC) from the MMH. the amino acid sequence of the ACE inhibitory peptides were Tyr -Val-Ala. The IC50 of this peptide for ACE from rabbit lung was 1.4μM. Peptide which inhibit the Angiotensin Ⅰ-converting enzyme(ACE) was prepared from Alaska pollack muscle by protease. The ACE inhibitory activity of Alaska pollack muscle hydrolysate(PMH) was 145㎍ of IC50. ACE inhibitory peptides were isolated by ultrafiltration, gel permeation column chromatography(GPC), reversed phase column chromatography(RPC), reversed phase-high performance liquid chromatography(RP-HPLC), and gel permeation high performance liquid chromatography(GP-HPLC) from the PMH. The amino acid sequence of the ACE inhibitory peptide was Ala-Leu-Leu. The IC50 of this peptide for ACE from rabbit lung was 0.8μM.

목차 Contents

• 제 1 장 서 론...26
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황...28
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과...35
• 제1절. 연구개발수행 내용...35
• 1. 연구내용(범위)...35
• 2. 재 료...35
• 3. 방 법...36
• 가. 시료의 전처리 및 수산단백질의 분리...36
• 나. 어육 peptide의 탈색 및 이취 제거...36
• 다. Peptide의 함량 및 분자량 측정...36
• 라. Peptide의 분리 정제...38
• 마. 아미노산 배열(amino acid sequence)의 분석...39
• 바. Angiotensin 1 전환 효소(ACE) 沮害作用...40
• 사. in vivo에서의 항고혈압 효과 측정...40
• 아. 아미노산 분석...41
• 제2절 결과 및 고찰...42
• 1. 수산단백질자원의 이화학적 특성...42
• 2. 원료의 전처리 조건 검토...42
• 가. 탈지한 어육분말의 제조 방법...43
• (1) 용매처리에 의한 탈지분말제조...43
• (2) 알칼리용액의 처리에 의한 탈지어육분말제조...43
• (3) 수세처리에 의한 명태 어육분말 제조...44
• 3. 어육 Peptide 제조...44
• 가. 단백질 가수분해물의 제조...44
• (1) 가수분해 효소...44
• (2) 효소에 의한 가수분해 조건 설정...45
• 나. 펩타이드 제조...54
• 다. 분자량 측정...56
• 4. Peptide의 분리 정제...59
• 가. Membrane에 의한 어육가수분해물의 분획...59
• 나. Peptide의 탈색 및 탈취...61
• 다. 아미노산 분석...66
• 5. Angiotensin 1 전환 효소(ACE) 沮害作用...70
• 가. 명태 펩타이드의 분리 정제...72
• 나. 고등어 펩타이드의 분리 정제...81
• 6. in vivo에서의 항고혈압 효과 측정...89
• 제 4 장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도...93
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획...94
• 제 6 장 참고문헌...95